3 食品中黄曲霉毒素测定 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定 出12种，包括B1、B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H1、GM、B2。 和毒醇。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢 呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻 酮(香豆素)。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲 霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主 要分子型式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中M1和M2主要存在 于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。在紫外线下，黄曲霉 毒素B1、B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉 毒素的相对分子量为312～346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙 酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在 中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解。 在pH9—10的强酸溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐 高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃紫外线对低浓度黄曲霉 毒素有一定的破坏性
3 食品中黄曲霉毒素测定 黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定 出12种，包括B1、B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H1、GM、B2。 和毒醇。黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢 呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻 酮(香豆素)。前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。M1是黄曲 霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主 要分子型式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中M1和M2主要存在 于牛奶中。B1为毒性及致癌性最强的物质。在紫外线下，黄曲霉 毒素B1、B2发蓝色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。黄曲霉 毒素的相对分子量为312～346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙 酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在 中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解。 在pH9—10的强酸溶液中分解迅速。其纯品为无色结晶，耐 高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268℃紫外线对低浓度黄曲霉 毒素有一定的破坏性
3.1．薄层层析法 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990 年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准 方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。 3.1.1 原理 本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓 缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其 在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0．000 4ug，最低检出 浓度为5ug／Kg。
3.1．薄层层析法 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990 年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准 方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。 3.1.1 原理 本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓 缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其 在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 薄层色谱法黄曲霉毒素Bt的最低检出量为0．000 4ug，最低检出 浓度为5ug／Kg。
3.1.2 仪器和试剂 (1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板 5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯 100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)试剂 ①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲 醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试 剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐 一进行重蒸。 ②硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙 腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 ③黄曲霉毒素B1标准液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先 加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。 此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再 用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm， AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800
3.1.2 仪器和试剂 (1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板 5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯 100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)试剂 ①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲 醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试 剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐 一进行重蒸。 ②硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙 腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 ③黄曲霉毒素B1标准液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先 加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。 此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再 用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm， AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800
④黄曲霉毒素B：标准使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容 量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。 ⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅 拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。 将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。污染 的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果
④黄曲霉毒素B：标准使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容 量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。 ⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅 拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。 将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。污染 的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果
3.1.3操作步骤 (1)样品处理 样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～lkg后全部粉碎。 粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。 (2)提取 称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石 油醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏。振荡30min，静置片 刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分 清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于 4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分 层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约 10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿 中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于 蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放 在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加 入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯 的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用 此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中
3.1.3操作步骤 (1)样品处理 样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～lkg后全部粉碎。 粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。 (2)提取 称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石 油醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏。振荡30min，静置片 刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分 清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL甲醇水溶液(相当于 4.0g样品)置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分 层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约 10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿 中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于 蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放 在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加 入1mL苯一乙腈混合液。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯 的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用 此滴管吸取上清液转移于2mL的具塞试管中
(3)测定 ①单向展开法 a．薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒人 涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在 100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可 再活化后使用。 b．点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量 注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm， 点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸 边加。滴加样式如下： 第一点：10μL AFTB，标准使用液(0．04μg／mL)。 第二点：20μL样液。第三点：20μL样液+10μL 0.04μg／mL AFTBl标准使用液。 第四点：20μL样液+10μL 0.02tLg，／m L AFTB。标准使用液。 ②展开与观察 在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一 展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观 察结果，方法如下：
(3)测定 ①单向展开法 a．薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒人 涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在 100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可 再活化后使用。 b．点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量 注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm， 点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸 边加。滴加样式如下： 第一点：10μL AFTB，标准使用液(0．04μg／mL)。 第二点：20μL样液。第三点：20μL样液+10μL 0.04μg／mL AFTBl标准使用液。 第四点：20μL样液+10μL 0.02tLg，／m L AFTB。标准使用液。 ②展开与观察 在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一 展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观 察结果，方法如下：
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点 重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中 AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四 点AFTB1标准为0．002ug．主要起定位作用。 b．若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl 含量<5ug／kg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。 ③确证试验 为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙 酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依 次滴加两个点。 第一点：10uL 0．04ug／mL AFTBl标准使用液。第二点：20／μL样液于以上 两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温 度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：10uL 0.04ug／mL AFTBl标准使用液。第四点：20μL样液
a．由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点 重叠。若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0．000 4μg，可用作检查样液中 AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用。薄层板上第四 点AFTB1标准为0．002ug．主要起定位作用。 b．若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl 含量<5ug／kg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验。 ③确证试验 为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙 酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依 次滴加两个点。 第一点：10uL 0．04ug／mL AFTBl标准使用液。第二点：20／μL样液于以上 两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温 度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：10uL 0.04ug／mL AFTBl标准使用液。第四点：20μL样液
按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍 生物空白对照。 ④稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。 标准点最低检出量(0.00 04μg)的荧光强度一致，则样品中AFTB1 含量为即为5~g／kg． 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少 滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧 光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：l0uL AFTB1，标准使用液(0.04ug／mL)。 第二点：根据情况滴加10uL样液。 第三点：根据情况滴加15uL样液。 第四点：根据情况滴加20uL样液
按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍 生物空白对照。 ④稀释定量：样液中的AFTB1荧光点的荧光强度，如与AFTB1。 标准点最低检出量(0.00 04μg)的荧光强度一致，则样品中AFTB1 含量为即为5~g／kg． 若样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计，减少 滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液的荧 光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：l0uL AFTB1，标准使用液(0.04ug／mL)。 第二点：根据情况滴加10uL样液。 第三点：根据情况滴加15uL样液。 第四点：根据情况滴加20uL样液
4)结果计算 X = 式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL； V2—出现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D一样液的总稀释倍数； m1—加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g； 0.0004—AFTBl的最低检出限量，ug
4)结果计算 X = 式中：X 一 样品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的体积，mL； V2—出现最低荧光时滴加样液的体积，mL； D一样液的总稀释倍数； m1—加入苯一乙腈混合液溶解时相当样品的质量，g； 0.0004—AFTBl的最低检出限量，ug
3.2．双向展开法 3.2.1 原理 如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧 光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开， 将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮 一三氯甲烷(8+92)做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减 少，因而提高了方法的灵敏度。 3.2.2操作步骤 (1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘 0．8～1cm第二篇食品理化检测技术处，各滴加10uL AFTB1 (0.04ug／mL)标准液，在距左边缘2.8～3cm处，各滴加 20uL样液。然后在第二块板的样液点上滴加l0uL AFTBl (0.04ug ／mL)标准液，在第三块板的样液点上滴加10uL AFTB1 (0.02ug ／mL)标准液
3.2．双向展开法 3.2.1 原理 如用单向展开法后，薄层色谱由于杂质干扰掩盖了AFTB1的荧 光强度，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚做横向展开， 将干扰的杂质展至样液点的一边，而AFTB1不动，然后再用丙酮 一三氯甲烷(8+92)做纵向展开，样品在相应处的杂质底色大量减 少，因而提高了方法的灵敏度。 3.2.2操作步骤 (1)点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上，在距左边缘 0．8～1cm第二篇食品理化检测技术处，各滴加10uL AFTB1 (0.04ug／mL)标准液，在距左边缘2.8～3cm处，各滴加 20uL样液。然后在第二块板的样液点上滴加l0uL AFTBl (0.04ug ／mL)标准液，在第三块板的样液点上滴加10uL AFTB1 (0.02ug ／mL)标准液