醋酸纤维薄膜电泳法分离 血清蛋白质 ·生化与分子生物学系 ·生命科学学院 ·四川农业大学
醋酸纤维薄膜电泳法分离 血清蛋白质 • 生化与分子生物学系 • 生命科学学院 • 四川农业大学
目录 Content 实验目的 实验原理 实验药品仪器 实验步豫 结果分析 注意事项
C o n t e n t 结果分析 Ø . 实验目的 Ø . Ø . Ø . 实验原理 实验药品仪器 实验步骤 Ø . Ø . 注意事项
实验目的 1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作 2.了解电泳技术的原理 3.了解血清蛋白质的分离，鉴定
实验目的 1. 掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作 2. 了解电泳技术的原理 3. 了解血清蛋白质的分离，鉴定
格 实验原理 1.带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳： 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技 术。 2.蛋白质分子是两性电解质，在H值小于其等电点的溶液中，蛋白 质分子结合一部分+而带正电，在电场中向负极移动，在H值大于 其等电点的溶液中，蛋白质分子解离出+而带负电，在电场中向正 极移动。 H +H +H pHpl （净电荷：+) (净电荷：0) (净电荷：-) 向电场负极移动 不移动 向电场正极移动
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验原理 1.带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技 术。 2.蛋白质分子是两性电解质，在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白 质分子结合一部分H+而带正电，在电场中向负极移动，在pH值大于 其等电点的溶液中，蛋白质分子解离出H+而带负电，在电场中向正 极移动
实验原理 3影响电泳的主要因素： 1)电泳介质的pH:溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质 所带净电荷的多少。为了保证电泳过程中溶液的H值恒定，必须采用缓 冲溶液。 2)缓冲液的离子强度：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰； 离子强度高，区带分离清晰。但离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使 电泳速度减慢。所以常用离子强度为0.02一0.2之间。 3)电场强度：电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。但电压增加，相 应电流也增大，电流过大时易产生热效应使蛋白质变性而不能分离。可分 高压电泳和常压电泳。 4)电渗作用：在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。 5)样品自身等电点，分子质量和分子形状的不同
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验原理 3.影响电泳的主要因素： 1）电泳介质的pH：溶液的pH值决定带电物质的解离程度，也决定物质 所带净电荷的多少。为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓 冲溶液。 2）缓冲液的离子强度：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰； 离子强度高，区带分离清晰。但离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使 电泳速度减慢。所以常用离子强度为0.02—0.2之间。 3）电场强度：电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。但电压增加，相 应电流也增大，电流过大时易产生热效应使蛋白质变性而不能分离。可分 高压电泳和常压电泳。 4）电渗作用：在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。 5）样品自身等电点，分子质量和分子形状的不同
实验原理 4.血清蛋白质的等电点都小于7.5，在pH值为8.6缓冲液中带负电荷，在电 场中移向正极，血清中各种蛋白质由于带有的电荷数量及相对分子质量不 同，在电场中的迁移速度不同，故可利用电泳将它们分离。带电荷多及分 子质量小者泳动速度快，带电荷少及分子质量大者泳动速度慢。 人血清中主要蛋白质的等电点及相对分子质量 蛋白质名称 等电点pI 相对分子质量M: 白蛋白 4.88 69000 a1-球蛋白 5.06 200000 a2-球蛋白 5.06 300000 B-球蛋白 5.12 90000-150000 Y-球蛋白 6.857.50 156000-300000
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验原理 4.血清蛋白质的等电点都小于7.5，在pH 值为 8.6缓冲液中带负电荷，在电 场中移向正极，血清中各种蛋白质由于带有的电荷数量及相对分子质量不 同，在电场中的迁移速度不同，故可利用电泳将它们分离。带电荷多及分 子质量小者泳动速度快，带电荷少及分子质量大者泳动速度慢
实验药品及仪器 1、 药品 新鲜血清（无溶血），pH8.6巴比妥钠电极缓冲液，氨基黑10B染色液，漂洗液， 浸出液，透明液 (95%乙成来艺燕帽水) (0.4 mol/L NaOH) 氨甚黑10B染色液 正常人血清
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验药品及仪器 1、药品 新鲜血清（无溶血），pH8.6巴比妥钠电极缓冲液，氨基黑10B染色液，漂洗液， 浸出液，透明液
实验药品及仪器 2、仪器 电泳仪，醋酸纤维薄膜，载玻片，点样玻片，滤纸，纱布，剪刀，培养皿，摄子，分光光度计，恒温 水浴锅，水平电泳槽，脱色摇床，电吹风 云酸件雅海膜 定性滤纸 恒温水浴锅 直流稳压电泳礼 数显恒温水浴钢 HH-2 然面0面 每有公用 ●●e●●●●二 电吹风 52 培养
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验药品及仪器 2、仪器 电泳仪，醋酸纤维薄膜，载玻片，点样玻片，滤纸，纱布，剪刀，培养皿，摄子，分光光度计，恒温 水浴锅，水平电泳槽，脱色摇床，电吹风
实验步骤 1.准备电源：检查电泳仪是否良好，接好各导线。 2安装电泳槽：电泳槽要密闭，以使槽内蒸气饱和，避免水分蒸发。用导 线与电泳仪相连，注意正负极不要接错。(1)在电泳槽的两侧中各倒入 等量的电极缓冲液约350ml。(2)将浸透缓冲液的双层纱布放在电泳槽 的搁架上，平贴好。（也可以用滤纸代替纱布操作） 3.用摄子取一条8cm×2cm的醋酸纤维薄膜（预先浸于缓冲液中），放在 滤纸上，轻轻吸去多余的缓冲液，于无光泽（即反面）的一端1.5cm处轻 轻用铅笔画一直线，称为点样线或原线（如能笔直点样可不画原线)。 15c
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验步骤 1.准备电源 ： 检查电泳仪是否良好，接好各导线。 2.安装电泳槽 ： 电泳槽要密闭，以使槽内蒸气饱和，避免水分蒸发。用导 线与电泳仪相连，注意正负极不要接错。 （1）在电泳槽的两侧中各倒入 等量的电极缓冲液约 350ml。 （2）将浸透缓冲液的双层纱布放在电泳槽 的搁架上,平贴好。（也可以用滤纸代替纱布操作） 3.用摄子取一条 8 cm×2 cm 的醋酸纤维薄膜（预先浸于缓冲液中）, 放在 滤纸上，轻轻吸去多余的缓冲液，于无光泽（即反面）的一端 1.5 cm 处轻 轻用铅笔画一直线，称为点样线或原线（如能笔直点样可不画原线）
实验步骤 4.点样：取少量血清在载玻片上，用玻片的一端将血清涂布为均匀的一层， 用点样玻片的一端截面蘸取一定量的血清样品，轻轻点在点样线上。然后 将点有样品的薄膜，点样面向下，平贴在铺有纱布的电泳槽搁架上，盖好 电泳槽盖。注意：点样处应放在负极端。 N 5.电泳：打开电源开关，选择稳压，并调节电压至110V,通电60min后 关闭电源。 6染色：电泳完毕后，切断电源，用镊子将薄膜取出放入氨基黑10B染色 液中，染色5min
酶反应受到多种因索的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、 r , Il 位、激活剂和抑制剂等都 能影响酶反应速度，并川．各因索之间也相互影响（交互作川） 实验步骤 4.点样：取少量血清在载玻片上，用玻片的一端将血清涂布为均匀的一层， 用点样玻片的一端截面蘸取一定量的血清样品，轻轻点在点样线上。然后 将点有样品的薄膜，点样面向下，平贴在铺有纱布的电泳槽搁架上，盖好 电泳槽盖。注意：点样处应放在负极端。 5.电泳：打开电源开关，选择稳压，并调节电压至 110 V，通电 60 min后 关闭电源。 6.染色：电泳完毕后，切断电源，用镊子将薄膜取出放入氨基黑 10B 染色 液中，染色5 min