蛋白质浓度测定：考马斯亮蓝法 和紫外吸收法 生化与分子生物学系 生命科学学院 四川农业大学
蛋白质浓度测定：考马斯亮蓝法 和紫外吸收法 生化与分子生物学系 生命科学学院 四川农业大学
目录 1.蛋白质含量测定的意义 2.测定方法、原理、优缺点 3.药品和器材 4.主要步骤 5.实验结果及数据处理 6.注意事项
目录 1. 蛋白质含量测定的意义 2. 测定方法、原理、优缺点 3. 药品和器材 4. 主要步骤 5. 实验结果及数据处理 6. 注意事项
蛋白质含量测定的意义 ·生物体重要的组成成分。 ·食品的重要营养指标。 ·产品开发、优化、控制和质检等方面
蛋白质含量测定的意义 • 生物体重要的组成成分。 • 食品的重要营养指标。 • 产品开发、优化、控制和质检等方面。 • ……
测定方法 蛋白质含量不仅可根据其物理性质：折射率、体积质量（比重）、紫外光吸收及 近红外法来测定；也可利用蛋白质的化学性质，用化学反应方法，如凯氏定氮法、 双缩脲法、福林(Foli)-酚试剂法测定，还可用染色法，如用氨基黑l0B、考马斯亮 蓝测定；还可用萤光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。 上述方法中凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，是蛋白质含量测定的国际 和国家标准测定方法；而紫外吸收法、双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色 法是蛋白质含量测定的常用方法，它们操作简单快速，不需要昂贵的设备。 蛋白质测定方法各有优缺点，需要综合考虑样品纯度、干扰物质、灵敏度成本、 时间等要求而确定
测定方法 蛋白质含量不仅可根据其物理性质：折射率、体积质量（比重）、紫外光吸收及 近红外法来测定；也可利用蛋白质的化学性质，用化学反应方法，如凯氏定氮法、 双缩脲法、福林（Folin）-酚试剂法测定，还可用染色法，如用氨基黑10B、考马斯亮 蓝测定；还可用萤光激发、氯胺T、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法测定。 上述方法中凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，是蛋白质含量测定的国际 和国家标准测定方法；而紫外吸收法、双缩脲法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色 法是蛋白质含量测定的常用方法，它们操作简单快速，不需要昂贵的设备。 蛋白质测定方法各有优缺点，需要综合考虑样品纯度、干扰物质、灵敏度成本、 时间等要求而确定
凯氏定氮法 蛋白质是一类复杂的有机含氮化合物。其中每一种蛋白 质都有其恒定的含氮量，大约在14%~18%，平均为16%。 由凯氏定氮法测定出样品中的含氮量，再乘以系数6.25，即 得到样品蛋白质含量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中 的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨， 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。通常称此过程为“消化” 通常需要加入硫酸钾或疏酸钠以提高反应液的沸点，并加入 硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。 该法是蛋白质含量测定的国标法。 优点是准确度很高，可处理复杂样品；缺点是周期长， 不能区分N的来源（三聚氰胺事件）
蛋白质是一类复杂的有机含氮化合物。其中每一种蛋白 质都有其恒定的含氮量，大约在14%～18%，平均为16%。 由凯氏定氮法测定出样品中的含氮量，再乘以系数6.25，即 得到样品蛋白质含量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中 的碳、氢等元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨， 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。通常称此过程为“消化” 。 通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入 硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。 该法是蛋白质含量测定的国标法。 优点是准确度很高，可处理复杂样品；缺点是周期长， 不能区分N的来源（三聚氰胺事件）。 凯氏定氮法
双缩脲法(BCA法) 双缩脲在碱性条件下能与Cu+结合生成紫红色络 合物（称双缩脲反应）。而蛋白质分子中含有两个以 NH 上相邻的肽键，其结构与双缩脲类似，因此也能发生 双缩脲反应，生成紫红色络合物，其反应后溶液颜色 的深浅与蛋白质（浓度）含量在一定范围内呈线性关 系，符合比尔定律，而且与蛋白质的相对分子质量及 H 氨基酸成分无关，受蛋白质特异性影响较小，故可利 用此反应通过比色法测定蛋白质的含量，该法测定蛋 白质浓度范围为1~10mgmL。 Ig(Io/D)=K2C I为入射光强度 双缩脲法优点是快速、硫酸铵不干扰此显色反应， 有利于对蛋白质纯化早期步骤蛋白质的测定。缺点是 I为透过光强度 灵敏度偏低。 K2为吸收系数，为常数 C为吸光物质的浓度
双缩脲法（BCA法） 双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色络 合物（称双缩脲反应）。而蛋白质分子中含有两个以 上相邻的肽键，其结构与双缩脲类似，因此也能发生 双缩脲反应，生成紫红色络合物，其反应后溶液颜色 的深浅与蛋白质（浓度）含量在一定范围内呈线性关 系，符合比尔定律，而且与蛋白质的相对分子质量及 氨基酸成分无关，受蛋白质特异性影响较小，故可利 用此反应通过比色法测定蛋白质的含量，该法测定蛋 白质浓度范围为1～10 mg/mL。 双缩脲法优点是快速、硫酸铵不干扰此显色反应， 有利于对蛋白质纯化早期步骤蛋白质的测定。缺点是 灵敏度偏低。 lg(I0 /I)=K2C I0为入射光强度； I为透过光强度； K2为吸收系数，为常数； C为吸光物质的浓度
考马斯亮蓝法(Bradford法) 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中呈棕红色，可与蛋白质 O3S 的疏水微区结合，使蛋白质被“染色”呈现蓝色。在一定范围 内，溶液在595nm波长下的吸光值与蛋白质含量成正比， 符合比色法测定原理，因此可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝染料该法试剂配制简单，操作简便快捷， 灵敏度比Folin-酚法还高4倍，测定范围1~1000ug,而且 干扰物质少，蛋白质间的变动也较小，是一种常用的蛋白 Coomassie brilliant blue G-250 质快速、灵敏测定方法。 缺点是SDS等去污剂干扰、蛋白氨基酸组成影响、考马 斯亮蓝污染的试管不易清洗
考马斯亮蓝法（Bradford法） Coomassie brilliant blue G-250 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中呈棕红色，可与蛋白质 的疏水微区结合，使蛋白质被“染色”呈现蓝色。在一定范围 内，溶液在595 nm波长下的吸光值与蛋白质含量成正比， 符合比色法测定原理，因此可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝染料该法试剂配制简单，操作简便快捷， 灵敏度比Folin-酚法还高4倍，测定范围1～1 000 μg，而且 干扰物质少，蛋白质间的变动也较小，是一种常用的蛋白 质快速、灵敏测定方法。 缺点是SDS等去污剂干扰、蛋白氨基酸组成影响、考马 斯亮蓝污染的试管不易清洗
Phenylalanine Tryptophan (Phe)B (yn (TP)W 紫外吸收法 由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸， 因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处。在一定浓 度范围内(0.1~1.0mg/mL),蛋白质溶液在280nm处光吸收值A280 与其浓度成正比，故可用作蛋白质含量的定量测定。 Amino acid Absorption maxima(nm) 该测定方法简单、灵敏、快速、低浓度的盐类不干扰测定，同时 Tryptophan 219,279 在测定过程中无试剂加入，蛋白质可回收，特别适用于柱层析洗脱液 Tyrosine 193,222.275 Phenylalanine 188,206,257 的快速连续检测，因此在蛋白质和酶的分离纯化过程中广泛采用。 此法的缺点是：(1)对测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸 含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。(2)适合较纯蛋白质的测定， 若待测样中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，干扰较大
紫外吸收法 由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸， 因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280 nm处。在一定浓 度范围内（0.1～1.0 mg/mL），蛋白质溶液在280 nm处光吸收值A280 与其浓度成正比，故可用作蛋白质含量的定量测定。 该测定方法简单、灵敏、快速、低浓度的盐类不干扰测定，同时 在测定过程中无试剂加入，蛋白质可回收，特别适用于柱层析洗脱液 的快速连续检测，因此在蛋白质和酶的分离纯化过程中广泛采用。 此法的缺点是:（1）对测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸 含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。（2）适合较纯蛋白质的测定， 若待测样中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，干扰较大
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝法
主要药品 主要器材 亮蓝法 的语个找 09%Na@溶液 0.01%考马斯亮蓝G250溶液未知雷白质样品 VS
主要药品 主要器材 vs