回川裳掌大学 生命科學婆院 生化与分子生物学系 Sichuan Agricultural University College of Life Science 基础生物化学实验 实验五 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE) 测定蛋白质的相对分子质量
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目录/Contents 回川黑掌大学 01 实验目的 实验原理 03 实验药品、仪器 04 实验操作步骤 05 结果分析 06 注意事项
目录/Contents 01 实验目的 02 实验原理 03 实验药品、仪器 04 实验操作步骤 05 结果分析 06 注意事项
>1.实验目的 ⑩明回川裳耄大学 Sichuan Agricultural Universit ●学习SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理 ● 掌握垂直板电泳的操作方法 。学习考马斯亮蓝显色操作技术 了解标准曲线法测定蛋白质分子的方法
1.实验目的 l 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理 l 掌握垂直板电泳的操作方法 l 学习考马斯亮蓝显色操作技术 l 了解标准曲线法测定蛋白质分子的方法
》2.实验原理 ⑩回川震業大学 Sichuan Agricuttu时aUn时w◆rt ·SDS(阴离子去污剂)可 以变性蛋白质，且高密度 地与蛋白质结合，从而降 低或消除各种蛋白质分子 SDS 之间天然的电荷差异。 SDS-蛋白质复合物带有 负电荷，具有均一的电荷 天然蛋白质 变性蛋白质 密度，以及相同的荷质比
l SDS（阴离子去污剂）可 以变性蛋白质，且高密度 地与蛋白质结合，从而降 低或消除各种蛋白质分子 之间天然的电荷差异。 SDS-蛋白质复合物带有 负电荷，具有均一的电荷 密度，以及相同的荷质比。 2.实验原理 天然蛋白质 变性蛋白质
》2.实验原理 ⑩D川袭素大学 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS,能破坏蛋白质分子间的非共 价键，在强还原剂如巯基乙醇共用时，可打开蛋白质分子内的二硫键， SDS以其疏水基和蛋白质的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋 白质-SDS复合物。 蛋白质分子的电泳迁移率则主要取决于它的分子质量，而与所带 电荷和形状无关。该方法主要用于测定蛋白质分子中各亚基的分子量
2.实验原理 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，能破坏蛋白质分子间的非共 价键，在强还原剂如巯基乙醇共用时，可打开蛋白质分子内的二硫键， SDS以其疏水基和蛋白质的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋 白质-SDS 复合物。 蛋白质分子的电泳迁移率则主要取决于它的分子质量，而与所带 电荷和形状无关。该方法主要用于测定蛋白质分子中各亚基的分子量
>》2.实验原理 ⑩崩回川袭業大学 Sichuan Agricultural Universit -CH:-cH-[CH2-CH-]d+zCH-[CHz-CHlCH-CH- -0 NH. H H -CHz-CH-ICHz-CHLCHz-cH-[CHz-CHLCHzCH- kDa M 94.0 662 co -CH-CH-ICHCHI.CH-CH-ICH-CHCH 样本 6888 甲叉双丙猷腋 45.0 6.2 离子缺乏空间、 月000998 33.0 t6ooo0oo 26.0 Sample Well 分离胶 8808w°。 20.0 Direction of migration 14.4 分离 染色
2.实验原理 染色 分离
》2.实验原理 ⑩D川震掌大学 ●SDS-PAGE时，当蛋白质相对分子质量在11700~ Equstion y=a+b'x Ad1.R-squ098491 Value Stendard e 200000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直 50 ·兔碰酸化前B -Intercept 50935 0.03341 Slope 1143005321 48 牛血清白蛋白 线关系，符合以下方程式： 兔肌动蛋白 。牛秩酸酐酶 是胰蛋白两抑制剂 IgMw =bmg +K 42 ,鸡蛋清溶菌酶 0.0 02 0.4 05 0.8 式中，Mv为蛋白质相对分子质量；b为斜率；m为电泳 相对迁移率 相对迁移率；K为截距。在一定条件下，K和b均为常数
l SDS-PAGE时，当蛋白质相对分子质量在 11 700～ 200 000 时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈直 线关系，符合以下方程式： lgMW =bmR +K 式中，MW为蛋白质相对分子质量；b为斜率；mR为电泳 相对迁移率；K为截距。在一定条件下，K和b均为常数。 2.实验原理
>》3.实验药品、仪器 ⑩D川袭素大学 ●（1)实验材料为未知分子量蛋白样品。 (2)分离胶缓冲液（Tris-HCl,pH=8.8):称取18.17 g Tris,0.4gSDS,溶 于双蒸水，用3mol/LHCl调至pH=8.8,用双蒸水定容至100mL,其中Tris 为1.5mol/L,SDS为0.4%，4C存放。 (3)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl,pH-6.8):称取Tris6.06g,0.4gSDS,溶 于双蒸水，用3mo/LHCI调至pH=6.8,用双蒸水定容至100mL,其中Tis 为0.5mol/L,SDS为0.4%，4C存放
l （1）实验材料为未知分子量蛋白样品。 l （2）分离胶缓冲液（Tris-HCl，pH= 8.8）：称取 18.17 g Tris, 0.4 g SDS，溶 于双蒸水，用3 mol/L HCl 调至 pH =8.8，用双蒸水定容至 100 mL，其中 Tris 为 1.5 mol/L，SDS 为 0.4%，4℃存放。 l （3）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl，pH=6.8）：称取 Tris 6.06 g，0.4 g SDS，溶 于双蒸水，用3 mol/L HCl 调至 pH=6.8，用双蒸水定容至 100 mL，其中 Tris 为 0.5 mol/L，SDS 为 0.4%，4℃存放。 3.实验药品、仪器
>》3.实验药品、仪器 明回川果素大学 ●（4)30%丙烯酰胺N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（Acr/Bis):29.2gAcr、0.8g Bis,用双蒸水溶解，并定容至100L,装入棕色瓶备用，4C保存。 ●(5)10%过硫酸铵(AP,WN):称取过硫酸铵NH)2S20g1g,溶于10mL 双蒸水中，临用时配制。 )（6)2倍上样缓冲液(Tris-HCl,pH=8.0):含0.5mol/LTris-HCl(pH6.8） 2mL,甘油2mL,20%SDS(WW)2mL,0.1%溴酚蓝0.5mL,2-β-巯基 乙醇1.0mL,双蒸水2.5mL(注：调完pH后再加疏基乙醇)
l （4）30%丙烯酰胺/N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（Acr/Bis）：29.2 g Acr、0.8 g Bis，用双蒸水溶解，并定容至 100 mL，装入棕色瓶备用，4℃保存。 l （5）10%过硫酸铵（AP，W/V）：称取过硫酸铵(NH4)2S2O8 1 g，溶于 10 mL 双蒸水中，临用时配制。 l （6）2 倍上样缓冲液（Tris-HCl，pH= 8.0）：含 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8） 2 mL，甘油 2 mL，20% SDS （W/V）2 mL，0.1% 溴酚蓝 0.5 mL，2-β-巯基 乙醇 1.0 mL，双蒸水 2.5 mL（注：调完pH后再加巯基乙醇）。 3.实验药品、仪器
>3.实验药品、仪器 ⑩D川震掌大学 Sichuan Agricuttu时aUn时w◆rt ●（7)电极缓冲液（Tis-甘氨酸，pH8.3):称取3.03 g Tris,14.41g甘氨酸， 1.0gSDS,溶于双蒸水，用HCl调pH至8.3（若准确称量则无需再调pH), 定容至1000mL。 （8)染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。 （9)脱色液：①酸-甲醇-水脱色液：25%甲醇，10%乙酸。②7%(VV) 乙酸脱色液：取冰乙酸7mL,加蒸馏水100mL
3.实验药品、仪器 l （7）电极缓冲液（Tris-甘氨酸，pH 8.3）：称取 3.03g Tris, 14.41g 甘氨酸， 1.0g SDS，溶于双蒸水，用HCl 调 pH 至 8.3（若准确称量则无需再调 pH）， 定容至 1 000 mL。 l （8）染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝 R-250。 l （9）脱色液：① 酸-甲醇-水脱色液：25% 甲醇，10% 乙酸。② 7%（V/V） 乙酸脱色液：取冰乙酸 7 mL，加蒸馏水 100 mL