第十章蛋白质和氨基酸的测定 第一节概述 1,蛋白质是生命的物质基础： 是构成细胞的组成成分：细胞膜中的蛋白质，线粒体、内质网等细 胞器上的结构蛋白或酶，染色体中的核蛋白，血液中的血红蛋白，也是激素 和抗体的基本成分。 2, 担当重要的生理功能： 是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源， 物质代谢的生物催化剂， 营养物质及气体的运输 遗传信息的传递与表达 人体内的组质液pH(健康H在7.3-7.5之间)及水分的平衡 为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体； 一般认为成人每人每天营养需要量为：75克蛋白质
第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 1，蛋白质是生命的物质基础： 是构成细胞的组成成分：细胞膜中的蛋白质，线粒体、内质网等细 胞器上的结构蛋白或酶，染色体中的核蛋白，血液中的血红蛋白，也是激素 和抗体的基本成分。 2， 担当重要的生理功能： 是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源， 物质代谢的生物催化剂， 营养物质及气体的运输 遗传信息的传递与表达 人体内的组质液pH（健康pH在7.3－7.5之间）及水分的平衡 为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体； 一般认为成人每人每天营养需要量为：75克蛋白质
蛋白质的组成及特性 蛋白质的组成： 蛋白质由很多的AA单体以肽键结合而成的具有一定空间结构的含氮有机化合 物，有的含有P、S、Cu、Fe、I等元秦，分子量高达数万~数百万。含氮是 蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。 蛋白质系数：一般而言，蛋白质含氮量约为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白 质，此数值(6.25)称为蛋白质系数。 氨基酸的种类： 自然界中已经发现的氨基酸约有170多种，其中组成蛋白的氨基酸只有22种 (都是-AA)，其中对人而言的必需氨基酸有8种（犬的必需氨基酸有9种） 组成蛋白的氨基酸(a-AA)的通式及AA两性电解质特性： NH OH- NH OH- NH: H+ COOH C00- COO 阳离子 兼性离子 阴离子 pHpl
蛋白质的组成及特性 蛋白质的组成: 蛋白质由很多的AA单体以肽键结合而成的具有一定空间结构的含氮有机化合 物，有的含有P、S、 Cu、Fe、I等元素，分子量高达数万～数百万。含氮是 蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。 蛋白质系数：一般而言，蛋白质含氮量约为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白 质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 氨基酸的种类: 自然界中已经发现的氨基酸约有170多种，其中组成蛋白的氨基酸只有22种 （都是-AA），其中对人而言的必需氨基酸有8种（犬的必需氨基酸有9种）。 组成蛋白的氨基酸（-AA）的通式及AA两性电解质特性：
部分食品的蛋白质含量 谷类和面食： (%) 肉、家禽、鱼： 大米（糙米、长粒、生） 7.9 牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5 大米（白米、长粒、生） 7.1 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 小麦粉（整粒） 13.7 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生）23.，1 玉米粉（整粒、黄色） 6.9 火腿（切片、普通的） 17.6 玉米淀粉 0.3 鸡蛋（生、全蛋） 12.5 豆类： 鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.9 大豆（成熟的种子、生） 36.5 鱼（罐装金枪鱼滴干的固体）26.5 豆（腰子状、所有品种） 23.6 乳制品： 豆腐（生、普通） 8.1 牛乳（全脂、液体） 3.3 水果和蔬菜： 牛乳（脱脂、干） 36.2 苹果（生、带皮） 0.2 干酪 24.9 芦笋（生） 2.3 酸奶（普通的、低脂） 5.3 草莓（生） 0.6 莴苣（冰、生） 1.0
部分食品的蛋白质含量 谷类和面食： （%） 大米（糙米、长粒、生） 7.9 大米（白米、长粒、生） 7.1 小麦粉（整粒） 13.7 玉米粉（整粒、黄色） 6.9 玉米淀粉 0.3 豆类： 大豆（成熟的种子、生） 36.5 豆（腰子状、所有品种） 23.6 豆腐（生、普通） 8.1 水果和蔬菜： 苹果（生、带皮） 0.2 芦笋（生） 2.3 草莓（生） 0.6 莴苣（冰、生） 1.0 肉、家禽、鱼： 牛肉（颈肉、烤前腿） 18.5 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、生） 23.1 火腿（切片、普通的） 17.6 鸡蛋（生、全蛋） 12.5 鱼（太平洋鳕鱼、生） 17.9 鱼（罐装金枪鱼滴干的固体） 26.5 乳制品： 牛乳（全脂、液体） 3.3 牛乳（脱脂、干） 36.2 干酪 24.9 酸奶（普通的、低脂） 5.3
优质蛋白质（对人类而言） 必需氨基酸： 在组成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人类而言，优质蛋白质的定义： ●蛋白质中必需氨基酸的含量高，且总体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白氨 基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。 一般而言：动物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较多，而植物性蛋白所 含必需氨基酸的种类及数量较少。 若蛋白质或某些必需氨基酸供给不足： ● 会导生物体生长发育缓慢，体重减轻，抵抗力下降，容易患病： 男性精液品质下降，精子数量减少，性欲降低； 女性引起不孕，即使怀孕，胎儿也常发育不良而发生死胎或畸胎。 开发蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等是食品科学从业者的一项重要任务！
优质蛋白质（对人类而言） 必需氨基酸： 在组成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人类而言,优质蛋白质的定义: l 蛋白质中必需氨基酸的含量高,且总体氨基酸的组成比例接近母乳蛋白氨 基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。 一般而言：动物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较多,而植物性蛋白所 含必需氨基酸的种类及数量较少。 若蛋白质或某些必需氨基酸供给不足： l 会导生物体生长发育缓慢，体重减轻，抵抗力下降，容易患病； l 男性精液品质下降，精子数量减少，性欲降低； l 女性引起不孕，即使怀孕，胎儿也常发育不良而发生死胎或畸胎。 开发蛋白质的生理效价高的食品及合理配膳等 是食品科学从业者的一项重要任务！
常用的蛋白质和氨基酸的测定方法 常用的蛋白质和氨基酸的测定方法： 蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，准确、操作较费时，在国内外 应用普遍。 双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简 便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 另外，国外采用近红外分析仪，利用波长在0.75~3μm范围内的近红外线具 有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了近红外光谱快速定量方法。 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。 本章重点： 凯氏定氮法的原理及注意事项，双缩脲法、印三酮法及氨基酸自动分析仪的 原理及注意事项，动物实验法，氨基酸总量的测定
常用的蛋白质和氨基酸的测定方法 常用的蛋白质和氨基酸的测定方法： 蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，准确、操作较费时，在国内外 应用普遍。 双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简 便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 另外，国外采用近红外分析仪，利用波长在0.75～3μm范围内的近红外线具 有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了近红外光谱快速定量方法。 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。 本章重点： 凯氏定氮法的原理及注意事项，双缩脲法、印三酮法及氨基酸自动分析仪的 原理及注意事项，动物实验法，氨基酸总量的测定
第二节蛋白质的定性测定 考马斯亮蓝法(Stain with Coomassie blue)):考马斯亮蓝法 灵敏度比氨基黑高玉倍，尤基适用手D电泳的微量军三质的 九品 在549nm有最大吸值蛋白质在1~10g线性笑系 奇检测出0.1ug的金当廣累带.苣银染法可以检测屈2ng的 蛋白质条带. Casting stand Casting frame and glass plate sandwich wwwwwww Clamping frame Plastic combs and electrode assembly Glass plates with Sample loading integrated spacers guides
第二节 蛋白质的定性测定 考马斯亮蓝法 (Stain with Coomassie blue)：考马斯亮蓝法 灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的 染色。在549nm有最大吸收值，蛋白质在1～10μg呈线性关系。 可以检测出0.1 ug 的蛋白质条带. 但银染法可以检测出 2 ng的 蛋白质条带
Coomassie Blue STAINING PROCEDURES 1.Reagents Coomassie Blue R-250 Methanol Glacial acetic acid 2.Gel Stainning solution,1L 1.0 g Commassie Blue R-250 450 ml water 450 ml methanol 100 ml Glacial acetic acid 3.Gel destaining solution,1 L 100 ml Methanol 100 ml Glacial acetic acid 800 ml Water 4.Staining Procedure 1. Pick up the gel into (20 ml,usually enough)Staining solution in a container and a gitate for 10 min for 0.75 mm Gel and 20 min and 1.5 mm gel.The staining solution can be reused several times. 2. Take the gel out and rinse the gel with a few changes of water in a new container 3. Add 50 ml destaining solution.Strong bands are visiable immediately on a light bo x,and 1 hour usually is enough. To destain completely,change destaining solution 2-3 times and agitate overnight. 5. Scan or take photo to record the result
Coomassie Blue STAINING PROCEDURES 1. Reagents Coomassie Blue R-250 Methanol Glacial acetic acid 2. Gel Stainning solution, 1 L 1.0 g Commassie Blue R-250 450 ml water 450 ml methanol 100 ml Glacial acetic acid 3. Gel destaining solution, 1 L 100 ml Methanol 100 ml Glacial acetic acid 800 ml Water 4. Staining Procedure 1. Pick up the gel into (20 ml, usually enough) Staining solution in a container and a gitate for 10 min for 0.75 mm Gel and 20 min and 1.5 mm gel. The staining solution can be reused several times. 2. Take the gel out and rinse the gel with a few changes of water in a new container 3. Add 50 ml destaining solution. Strong bands are visiable immediately on a light bo x, and 1 hour usually is enough. 4. To destain completely, change destaining solution 2-3 times and agitate overnight. 5. Scan or take photo to record the result
Coomassie Blue STAINING PROCEDURES 4.银染法(Silver staining):an dete1 as little as2 g of protein in a single ba di山SDSA Reagents: Silver nitrate Sodilum hydroxide 30%ammonium hydroxide citric acid 38%formaldehyde Methanol Acetic acid Staining procedure 1. Sock gel in 50%Methanol-10%acetic acid for at least 1 hour with 2-3 ch an ges of socking solution 2. Rinse gel with 3 changes of water for total 30 minutes. 3 silver staining for 15 mins Rinse gel with twice in deionized water 5 Developgel with developing solution stop development by ringsing in 1%acetic acid. 。 wash gel in water for at least 1 hour
Coomassie Blue STAINING PROCEDURES 4. 银染法(Silver staining): can detect as little as 2 ng of protein in a single ban d in SDS-PAGE Gel. Reagents: Silver nitrate Sodilum hydroxide 30% ammonium hydroxide citric acid 38% formaldehyde Methanol Acetic acid Staining procedure 1. Sock gel in 50% Methanol-10% acetic acid for at least 1 hour with 2-3 ch an ges of socking solution 2. Rinse gel with 3 changes of water for total 30 minutes. 3. silver staining for 15 mins 4. Rinse gel with twice in deionized water 5. Develop gel with developing solution 6. stop development by ringsing in 1% acetic acid. 7。 wash gel in water for at least 1 hour
2DE 2-DE:the technique to separate proteins in the first dimension according to t heir isoelectric point,by Isoelectric Focusing(IEF),and in the second dimensi on according to their molecular weight,by SDS-PAGE.2-DE combined with protein identification basing on microsequencing,amino acid composition an d Mass spectrometry,provides an invaluable tool for proteomic studies. Step 1-Sample Prep Step 2-First-Dimension(IEF)Separation Step 3-Second-Dimension(SDS-PAGE)Separation Step 4-Protein Detection by Staining/Destaining +3-0 -59 ◆310W
2DE 2-DE: the technique to separate proteins in the first dimension according to t heir isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the second dimensi on according to their molecular weight, by SDS-PAGE. 2-DE combined with protein identification basing on microsequencing, amino acid composition an d Mass spectrometry, provides an invaluable tool for proteomic studies. Step 1 — Sample Prep Step 2 — First-Dimension (IEF) Separation Step 3 — Second-Dimension (SDS-PAGE) Separation Step 4 — Protein Detection by Staining /Destaining
凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可 得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测 定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含 氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。 凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成 常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍 被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮法的原理及步骤。 原理： 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳 和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化 硫，样品中的有机氨转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵；然 后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐 酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量
凯氏定氮法 凯氏定氮法是先测定总氮量, 然后乘以蛋白质换算系数，即可 得到粗蛋白质含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测 定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含 氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。 凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成 常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍 被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮法的原理及步骤。 原理: 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳 和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化 硫，样品中的有机氮转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵; 然 后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐 酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量