吉林粮食高等专科教案 第三节 黄曲霉毒素的测定 教学目的：通过本节课学习，使大家掌握黄曲霉毒素 的测定方法，尤其是薄层层析法测 AFTB1。 教学重点：薄层层析法测 AFTB1 教学内容： 一、概述 二、与分析有关的黄曲霉毒素的理化性质 三、AFT 的测定方法 教学方法：理论讲解、实验辅助教学。 教学时间：2 学时 教学要求：积极思考、认真笔记、准确理解。 授课实施 一、 概述 （一） 发现经过 1960 年，英国发生了十万只火鸡因食用了发 霉的花生粉中毒死亡的事件。 当时，不知道死亡原因，经解剖中毒死鸡，发现：肝脏出 血、坏死、胆管上皮细胞异常增生。 后来，经过大量试验，从霉变的花生中分离出了黄曲霉。 火鸡死因正是由于黄曲霉的产毒菌株产生的毒素造成的， 并定名为黄曲霉毒素（A flatoxins）简称 AFT。 （二）、黄曲霉毒素结构 AFT 是黄曲霉、寄生曲霉的产毒菌株的代谢产特物。是一 类结构相似的化合物的混合物，基本结物是二呋喃和氧杂 萘邻酮。1963 年弄清了 AFT 的化学结构，到目前为止已鉴
吉林粮食高等专科教案 第三节 黄曲霉毒素的测定 教学目的：通过本节课学习，使大家掌握黄曲霉毒素 的测定方法，尤其是薄层层析法测 AFTB1。 教学重点：薄层层析法测 AFTB1 教学内容： 一、概述 二、与分析有关的黄曲霉毒素的理化性质 三、AFT 的测定方法 教学方法：理论讲解、实验辅助教学。 教学时间：2 学时 教学要求：积极思考、认真笔记、准确理解。 授课实施 一、 概述 （一） 发现经过 1960 年，英国发生了十万只火鸡因食用了发 霉的花生粉中毒死亡的事件。 当时，不知道死亡原因，经解剖中毒死鸡，发现：肝脏出 血、坏死、胆管上皮细胞异常增生。 后来，经过大量试验，从霉变的花生中分离出了黄曲霉。 火鸡死因正是由于黄曲霉的产毒菌株产生的毒素造成的， 并定名为黄曲霉毒素（A flatoxins）简称 AFT。 （二）、黄曲霉毒素结构 AFT 是黄曲霉、寄生曲霉的产毒菌株的代谢产特物。是一 类结构相似的化合物的混合物，基本结物是二呋喃和氧杂 萘邻酮。1963 年弄清了 AFT 的化学结构，到目前为止已鉴
吉林粮食高等专科教案 定出十多种同系物，例如 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、 AFTM1、AFTM2 等 AFT 的毒性与结构有关，凡二呋喃环未端有双键者，毒性 较强，而且有致癌性。AFT 是危害性最大的天然毒素之一。 （三）、毒性 AFT 属于剧毒物质，其毒性比氰化钾还强，其中毒性和致癌 性最大的是 AFTB1，另外，B2、G1、G2 和 M1 也具有强列的 毒性。毒性顺序：B1﹥B2﹥G1﹥M1﹥2G2﹥M2 等。 1、急慢性中毒 主要受害部位是肝脏。肝脏出血、坏死、肝细胞脂肪性变性 和胆管增生。 2、致癌性、 AFT 的致癌性已经由动物试验证明了，其中 AFTB1 具有最强的 致癌性。 动物长期摄入低浓度的 AFTB1 或短期摄入高浓度的 AFTB1 均可之诱发肝癌。别外，还可诱发肾癌、胃癌、沮腺癌、直肠 癌、乳癌、卵巢及小肠等部分的肿瘤。 AFT 对人类是否有致癌作用，虽然没直接证据证明，但国内 外许多研究者认为，某些地区有原发性肝癌流行，从流行病学 方面分析，可确定 AFT 是重要原因。 由于 AFT 能引起动物肝脏深度损伤及致癌，对人类健康威 肋及大，各国对 AFT 在食品中限量有严格规定。 （四）容许量 WHO 和 FAO 建议食品中 AFT 限量为：≤15ppb（1974 年）各 国的标准范围在 5——20ppb 之间。 也有国家认为食品中不得检出 AFT。 中国：GB27B1-81 规定 AFTB1 在各主要食品中容许量标准。 玉米、花生油、花生会及共物品≤20μg/kg 大米其它食用油≤10μg/kg 玉米及花生仁制品（按原料折算） 其它粮食、豆类、发酵食品≤5μg/kg 婴儿代乳食品不得检 出其它食品可参照以上标准执行。 二、与分析有关的黄曲霉毒素的理化性质 （一）稳定性 1、 对热稳定 AFT 耐热，一般的烹调温度下破坏很少，当温度达到 280℃时 可完全破坏。 2、 结晶的 AFTB1 紫外光照时也不能破坏它，但 AFTB1 的稀溶 液对紫外光很敏感
吉林粮食高等专科教案 定出十多种同系物，例如 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、 AFTM1、AFTM2 等 AFT 的毒性与结构有关，凡二呋喃环未端有双键者，毒性 较强，而且有致癌性。AFT 是危害性最大的天然毒素之一。 （三）、毒性 AFT 属于剧毒物质，其毒性比氰化钾还强，其中毒性和致癌 性最大的是 AFTB1，另外，B2、G1、G2 和 M1 也具有强列的 毒性。毒性顺序：B1﹥B2﹥G1﹥M1﹥2G2﹥M2 等。 1、急慢性中毒 主要受害部位是肝脏。肝脏出血、坏死、肝细胞脂肪性变性 和胆管增生。 2、致癌性、 AFT 的致癌性已经由动物试验证明了，其中 AFTB1 具有最强的 致癌性。 动物长期摄入低浓度的 AFTB1 或短期摄入高浓度的 AFTB1 均可之诱发肝癌。别外，还可诱发肾癌、胃癌、沮腺癌、直肠 癌、乳癌、卵巢及小肠等部分的肿瘤。 AFT 对人类是否有致癌作用，虽然没直接证据证明，但国内 外许多研究者认为，某些地区有原发性肝癌流行，从流行病学 方面分析，可确定 AFT 是重要原因。 由于 AFT 能引起动物肝脏深度损伤及致癌，对人类健康威 肋及大，各国对 AFT 在食品中限量有严格规定。 （四）容许量 WHO 和 FAO 建议食品中 AFT 限量为：≤15ppb（1974 年）各 国的标准范围在 5——20ppb 之间。 也有国家认为食品中不得检出 AFT。 中国：GB27B1-81 规定 AFTB1 在各主要食品中容许量标准。 玉米、花生油、花生会及共物品≤20μg/kg 大米其它食用油≤10μg/kg 玉米及花生仁制品（按原料折算） 其它粮食、豆类、发酵食品≤5μg/kg 婴儿代乳食品不得检 出其它食品可参照以上标准执行。 二、与分析有关的黄曲霉毒素的理化性质 （一）稳定性 1、 对热稳定 AFT 耐热，一般的烹调温度下破坏很少，当温度达到 280℃时 可完全破坏。 2、 结晶的 AFTB1 紫外光照时也不能破坏它，但 AFTB1 的稀溶 液对紫外光很敏感
吉林粮食高等专科教案 3、 遇氧化性物质，例：次氯酸钠、过氧化氢、高锰酸钾等均 可破坏。 4、 AFTB1 在中性和酸性溶液中稳定，在 HP1-3 的强酸性溶液 中稍有分解，在 PH9-10 的强碱性介质中能迅速分解，荧 光消先，但这种反应是可逆的，在酸性条件下又能产生有 蓝紫色荧光的 B1。 （二）溶解性 1、难溶于水，例如 AFTB1 在水中的最大溶解度为 10ppm。 2、溶于有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙腈、苯、二 甲基甲酸胺等。 3、不溶于已烷、石油醚、无水乙醚中。 （三）荧光反应 AFT 是一种在紫外光区可产生强烈特殊荧光的物质。 B 类：（B1、B2）在 365nm 紫外光下产生蓝紫色荧光； G 类：（G1、G2）在 365nm 紫外光下产生黄绿色荧光。 三、AFT 的测定方法 （一）发法发展概况 黄曲霉毒素的检测技术发展很快。 1、1963 年弄结构，以纸层析法和氧化铝薄层层析进行分离分析， 以目测法定量。灵敏度 0.1mg/kg,主要用于检测 B1。 需配合生物试验以便确证。故检验时间长。 2、1965 年改用硅藻土 G 或硅胶作吸附剂，进行薄层层析。以目 测法定量。中只能测 B1 和 G1。用化学及薄层层析法确证。 3、1966 年后开始使用荧光光密度计法定量，灵敏度 1.1μg/kg。 可分别测 B1、B2、G1、G2 四种毒素。 4、近年来，又发展了微柱层析法，取内径 0.4cm 玻璃管，制成氧化铝—砩罗里矽土的微柱，样品中的杂质 被氧化铝吸附，而黄曲霉毒素剂被砩罗里矽土吸附，将样品管与 标准管比较，进行定量。买敏度 10μg/kg，操作较薄层层层析法 简便迅速，可应用于大批量试样的筛选取试验。但此法只能测 AFT 总量。 在进行 AFTB1 的谱查中，首先用微柱法对大批样品筛选，如 果 AFT 不起过容许量，可不作确证试验和准确定量。如超过容许 量，再接着用薄层层析法作确证方式验，经确证试验认为确有 B1，再用最低检出量法定量。 别外，还可用气相色谱法和液相色谱法测定。 AFTB1、B2、G1、G2 通常共同存在，其含量之间存在一定的比例 关系。在天然被污染的食品中，一般以 B1 最多，而且 B1 的毒性 又最大，故食品中 AFTB1 的测定结果，具有一定的代表性。 （二）薄层层析法（测 AFTB1）
吉林粮食高等专科教案 3、 遇氧化性物质，例：次氯酸钠、过氧化氢、高锰酸钾等均 可破坏。 4、 AFTB1 在中性和酸性溶液中稳定，在 HP1-3 的强酸性溶液 中稍有分解，在 PH9-10 的强碱性介质中能迅速分解，荧 光消先，但这种反应是可逆的，在酸性条件下又能产生有 蓝紫色荧光的 B1。 （二）溶解性 1、难溶于水，例如 AFTB1 在水中的最大溶解度为 10ppm。 2、溶于有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙腈、苯、二 甲基甲酸胺等。 3、不溶于已烷、石油醚、无水乙醚中。 （三）荧光反应 AFT 是一种在紫外光区可产生强烈特殊荧光的物质。 B 类：（B1、B2）在 365nm 紫外光下产生蓝紫色荧光； G 类：（G1、G2）在 365nm 紫外光下产生黄绿色荧光。 三、AFT 的测定方法 （一）发法发展概况 黄曲霉毒素的检测技术发展很快。 1、1963 年弄结构，以纸层析法和氧化铝薄层层析进行分离分析， 以目测法定量。灵敏度 0.1mg/kg,主要用于检测 B1。 需配合生物试验以便确证。故检验时间长。 2、1965 年改用硅藻土 G 或硅胶作吸附剂，进行薄层层析。以目 测法定量。中只能测 B1 和 G1。用化学及薄层层析法确证。 3、1966 年后开始使用荧光光密度计法定量，灵敏度 1.1μg/kg。 可分别测 B1、B2、G1、G2 四种毒素。 4、近年来，又发展了微柱层析法，取内径 0.4cm 玻璃管，制成氧化铝—砩罗里矽土的微柱，样品中的杂质 被氧化铝吸附，而黄曲霉毒素剂被砩罗里矽土吸附，将样品管与 标准管比较，进行定量。买敏度 10μg/kg，操作较薄层层层析法 简便迅速，可应用于大批量试样的筛选取试验。但此法只能测 AFT 总量。 在进行 AFTB1 的谱查中，首先用微柱法对大批样品筛选，如 果 AFT 不起过容许量，可不作确证试验和准确定量。如超过容许 量，再接着用薄层层析法作确证方式验，经确证试验认为确有 B1，再用最低检出量法定量。 别外，还可用气相色谱法和液相色谱法测定。 AFTB1、B2、G1、G2 通常共同存在，其含量之间存在一定的比例 关系。在天然被污染的食品中，一般以 B1 最多，而且 B1 的毒性 又最大，故食品中 AFTB1 的测定结果，具有一定的代表性。 （二）薄层层析法（测 AFTB1）
吉林粮食高等专科教案 1、原理、 根据 AFTB1 的溶解性，经直接提取和萃取的方法将 AFTB1 从 样液中提取出来，AFTB1 在波长 365nm 的紫外光下产生蓝紫色荧 光，根据比移值定性，AFTB1 在薄层上显示荧光的最低检出量定 量（进行定性和定量分析）。 在一般实验条件下： AFTB1 最低检出量：0.0004μg。 方法灵敏度:5μg/kg。 比移值:0.6-0.7。 回收率:＞75%。 适用范围:适用于粮食、花生及制品、薯类、豆类、发酵食品及 酒类等各种食品中 AFTB1 的测定。 2、 操作条件的选择 ① 采样 样品中污染 AFTB1 的霉粒，一粒可左右测定结果，而且霉 粒比例一般分布不均匀，因此必需大量取样，并将大量粉 碎样品混合均匀，才能得到相对可靠的结果即采样时要注 意样品有代表性。 注意以下几点:a、取有代表性样品 b、局部发霉变质的样品，检验时单独取样。 ② 样品提取和净化提取 方法有两种。 甲法：正已烷-甲醇-水提取法。 适用于含油量或色素较多的样品。如：豆类、油类、花生、花 生酱等。也可用于玉米、大米、小麦及其制品。 提取机理： 利用 AFTB1 不溶于已烷（或石油醚）的性质，用石油醚溶解 并除去样品中的油脂和大部分色素。然后再用氯仿分配提取 AFTB1（在氯仿中的分配系数大），则试样中的水溶性杂质、 色素等仍溶于甲醇水溶液中，AFTB1 进入氯仿层，使 AFTB1 与大部分色素、杂质分开而达到提取净化的目的。 提取时注意事项： 分层是关键，应注意每次加试剂后要充分静置。 脱水过滤要慢，使脱水完全。 脱水后用的仪器，要吹干后使用，不得带水。 乙法：氯仿直接提取法。 适用于含杂质较少的食品。如：玉米、小麦、大米及制品。 ③、分离分析（单向展开法） 制板要求：（5×20cm） 硅胶 G：细度 200——300 目
吉林粮食高等专科教案 1、原理、 根据 AFTB1 的溶解性，经直接提取和萃取的方法将 AFTB1 从 样液中提取出来，AFTB1 在波长 365nm 的紫外光下产生蓝紫色荧 光，根据比移值定性，AFTB1 在薄层上显示荧光的最低检出量定 量（进行定性和定量分析）。 在一般实验条件下： AFTB1 最低检出量：0.0004μg。 方法灵敏度:5μg/kg。 比移值:0.6-0.7。 回收率:＞75%。 适用范围:适用于粮食、花生及制品、薯类、豆类、发酵食品及 酒类等各种食品中 AFTB1 的测定。 2、 操作条件的选择 ① 采样 样品中污染 AFTB1 的霉粒，一粒可左右测定结果，而且霉 粒比例一般分布不均匀，因此必需大量取样，并将大量粉 碎样品混合均匀，才能得到相对可靠的结果即采样时要注 意样品有代表性。 注意以下几点:a、取有代表性样品 b、局部发霉变质的样品，检验时单独取样。 ② 样品提取和净化提取 方法有两种。 甲法：正已烷-甲醇-水提取法。 适用于含油量或色素较多的样品。如：豆类、油类、花生、花 生酱等。也可用于玉米、大米、小麦及其制品。 提取机理： 利用 AFTB1 不溶于已烷（或石油醚）的性质，用石油醚溶解 并除去样品中的油脂和大部分色素。然后再用氯仿分配提取 AFTB1（在氯仿中的分配系数大），则试样中的水溶性杂质、 色素等仍溶于甲醇水溶液中，AFTB1 进入氯仿层，使 AFTB1 与大部分色素、杂质分开而达到提取净化的目的。 提取时注意事项： 分层是关键，应注意每次加试剂后要充分静置。 脱水过滤要慢，使脱水完全。 脱水后用的仪器，要吹干后使用，不得带水。 乙法：氯仿直接提取法。 适用于含杂质较少的食品。如：玉米、小麦、大米及制品。 ③、分离分析（单向展开法） 制板要求：（5×20cm） 硅胶 G：细度 200——300 目
吉林粮食高等专科教案 薄层厚度：0.25-0.3mm(湿层)。 100℃活化 2h,干燥器中存 2-3 天。 点样要求： 斑点直经＜3mm。 点样时要边吹冷风边滴加。 不要将薄层点穿。 换样前微量注射器每次用苯洗 2-3 次。 展开与观察： 采用二次展开法。 预展：用无水乙醚展至前沿 12cm，杂质（脂肪）推至前沿，B1 不动。 展开：用丙酮：氯仿展开至前沿 10cm，取出观察。 确证试验 为证实样液中的荧光物质确是 B1 产生的，可在 B1 点上滴加三氟 乙酸，通过反应产生 B1 的衍生物（B2a），展开后，此衍生物也 可产生蓝紫色荧光，比移值在 0.1 左右。 稀释定量 样液中 B1 的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致，则含量为 5μg/kg；强于最低检出量，可适当减少样液滴加的微升数或将样液 稀释后再滴加不同的微升数，直到样液点荧光强度与最低检出量一 致为上。 3、说明（略）
吉林粮食高等专科教案 薄层厚度：0.25-0.3mm(湿层)。 100℃活化 2h,干燥器中存 2-3 天。 点样要求： 斑点直经＜3mm。 点样时要边吹冷风边滴加。 不要将薄层点穿。 换样前微量注射器每次用苯洗 2-3 次。 展开与观察： 采用二次展开法。 预展：用无水乙醚展至前沿 12cm，杂质（脂肪）推至前沿，B1 不动。 展开：用丙酮：氯仿展开至前沿 10cm，取出观察。 确证试验 为证实样液中的荧光物质确是 B1 产生的，可在 B1 点上滴加三氟 乙酸，通过反应产生 B1 的衍生物（B2a），展开后，此衍生物也 可产生蓝紫色荧光，比移值在 0.1 左右。 稀释定量 样液中 B1 的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致，则含量为 5μg/kg；强于最低检出量，可适当减少样液滴加的微升数或将样液 稀释后再滴加不同的微升数，直到样液点荧光强度与最低检出量一 致为上。 3、说明（略）