第4章分子发光分析法 (Molecular Luminescence Analysis) 4.1分子荧光和磷光分析 (Molecular Fluorescence and Phosphorescence Analysis) 4.2化学发光分析 (Chemiluminescence Analysis) 分子发光包括荧光、磷光、化学发光,生物发光和散射光谱等。本章主要讨论前三种分子 发光分析 4.1分子荧光和磷光分析 (一)原理 1.荧光和磷光的产生 室温下,大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能热能、化 学能或光能等)后被激发为激发态.激发态不稳定将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随 着光子的辐射,这种现象称为“发光”。现在从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理 每个分子具有一系列严格分立的能级,称为电子能级,而每个电子能级中又包含一系列的 振动能层和转动能层,示意于图4.1.图中基态用So表示,第一电子激发单重态和第二电子激 发单重态分别用S1、S2表示,第一电子激发三重态和第二电子激发三重态分别用T、T2表示, =0、1、2,3…表示基态和激发态的振动能层 电子激发态的多重度用M=2s+1表示,S为电子自旋量子数的代数和,其数值为0或1 根据 Pauli不相容原理,分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向,即自旋 配对。假如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,即s=0,分子的多重度M=1,该分子 体系便处于单重态,用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。分子吸收能 量后,若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化,这时分子处于激发的单重态,如图4.1中 的S1和S2。如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变,这时分子便具有两个自旋不配 对的电子,即s=1,分子的多重度M=3,分子处于激发的三重态,用符号T表示。处于分立轨 道上的非成对电子,平行自旋要比成对自旋更稳定些(洪特规则)因此三重态能级总是比相应 的单重态能级略低,如图4.1中的T1和T2 处在激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基 态,其中以速度最快,激发态寿命最短的途径占优势。有以下儿种基木的去活化过程 (1)振动弛豫当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层v=0)跃迁到激发态S 的较高的振动能层上去。然而,在液相或压力足够高的气相中分子问碰撞的几率很大激发态 分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周的分子,而自身从Sn的高振动能层失活 到该电子能级的最低振动能层上,这一过程称为振动弛豫发生振动弛豫的时间为10-s数 84
单重态 三重态 振动弛豫 内转换 U=0 圭 Az a 外转换 激发 荧光(熄灭) 磷光振动范像 图4.1荧光和磷光体系能级图 量级。图4中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况 (2)荧光发射当分子处于单重激发态的最低振动能级时,去活化过程的一种形式是以 0-9~10-7左右的短时间内发射一个光子返回基态,这一过程称为荧光发射,。由于溶液中 振动弛豫效率很高,它在发射之前和发射之后都可能发生。因此、发射荧光的能量比分子所吸 收的能量要小,即荧光的特征波长比它所吸收的特征波长要长。根据 Kasha规则荧光多为 S1→S0跃迁 (3)内转换内转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子能 级的振动能层间有重叠时,则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子 激发态,如图4.1中S2和T2态的较低振动能层,与S1和T中的较高振动能层相重叠,重叠 的地方,两激发态间处于过渡性热平衡,低电子激发态通过振动耦合作用得到了累积。内转换 过程在10-3~10-"s时间内发生,它通常要比由高激发态直接发射光子的速度快得多.因 此如图4.1所示,分子最初无论在哪一个激发单重态,都能通过振动弛豫和内转换到达最低激 发单(或三)重态的最低振动能层上 (4)外转换激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光 强度减弱甚至消失的过程称外转换。这一现象称为“熄灭”或“猝灭” 由较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换,也可包含内转换 (5)系间跨越系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程,它涉及受激 电子自旋状态的改变。如S1→T1,使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻 85
的,但如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时,如图4中激发单重态S1的最低振动 能层与激发三重态T的较高振动能层重叠,则可能通过白旋-轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某一振动能层 (6)磷光发射从单重态到三重态的分子系问跨越跃迁发生后,接着发生快速的振动弛 豫而到达三重态的最低振动能层上,当没有其他过程同它竞争时,在10-4~10s左右时间内 跃迁回基态而发生磷光。由此可见,荧光与磷光的根本区别是:荧光是由激发单重态最低振动 能层至基态各振动能层的跃迁产生的,而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动 能层间跃迁产生的 2.激发光谱和发射光谱 任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱激发光谱和发射光谱。它们是荧光(磷光) 定性和定量分析的基本参数和依据., (1)激发光谱荧光和磷光都是光致发光,因此必须选择合适的激发光波长,这可从它们 的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时,选择荧光(磷光)的最大发射波长为测量波长 改变激发光的波长,测量荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图, 即得到荧光(磷光)化合物的激发光谱.激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似,经校正 后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同,而且波长位置也一样,这是因为物质分子吸收 能量的过程就是激发过程。 (2)发射光谱简称荧(磷)光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处,然后扫描 发射波长,测定不同发射波长处的荧(磷)光强度,即得到 荧(磷)光发射光谱。图42为茶的激发光谱、荧光发射光 谱和磷光发射光谱。荧光发射光谱显示了若干普遍的 特性。 i) Stokes位移.在溶液中,分子荧光的发射相对于 吸收位移到较长的波长,称为 Stokes位移。这是由于受 激分子通过振动弛豫而失去振动能,也由于溶液中溶剂分 子与受激分子的碰撞,也会有能量的损失。因此在激发和 发射之间产生了能量损失 (i)荧光发射光谱的形状与激发波长无关.如图4.1 所示,引起物质分子激发的波长是λ1和入2,但荧光的波长 图42莱的激发光谱(I)荧光都是2这是因为分子吸收了不同能量的光子可以由基 (Ⅱ)和磷光(亚)光谱 态激发到几个不同的电子激发态,而具有几个吸收带。由 于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的几率是很高的,远大于由高 能激发态直接发射光子的速度,故在荧光发射时,不论用哪一个波长的光辐射激发,电子都从 第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层,所以荧光发射光谱与激发波长 无关 〔i)镜像规则。通常荧光发射光谱和它的吸收光谱镜像对称关系,如图43所示的 蒽的荧光光谱和吸收光谱那样(不延伸到250nm的最大吸收处)。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层所致,其形状决定于第 电子激发态中各振动能层的分布情况。荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动
吸光 吸光 荧光 30 图43蒽的乙醇溶液的荧光光谱(右)和吸收光谙〔左) 能层回到基态中各不同能层所致,所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情 况.基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布的情况是类似的,因此荧光 光谱的形状和吸收光谱极为相似。由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发态各个振动能层 的吸收过程中,振动能层越高两个能层之间的能量差越大,即激发所需能量越高,所以吸收峰 的波长将越短.反之,由第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各个振动能层的荧光发 射过程中,基态振动能层越高,两个能层之间的 能量差越小,荧光峰的波长越长。另外,也可从 位能曲线解释镜像规则(见图44).由于光吸 收是在大约10s的短时间内发生的,在如此啊 短的时间内原子核没有明显的位移,即电子与 核之间的位置没有发生变化.其结果是,假如 在吸收过程中,基态的零振动能层与激发态的 第二振动能层之间的跃迁几率最大,那么在荧 离 波长 光发射过程中,其相反跃迁的儿率也应该最 图44镜像规则 大.也就是说,吸收和发射的能量都最大 3.荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件:(i)分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构, 才能吸收激发光;(i)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后,必须具有一定的荧光量子 产率 荧光量子产率(q)也称荧光效率或量子效率,它表示物质发射荧光的能力,通常用下式 表示 =发射的光量子数 吸收的光量子数 许多吸光物质并不能发射荧光,因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外,还有许 多上节所述的辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。荧光的量子产率与上述每一个过程的速率常 数有关。可以数学式表示如下 式中kr为荧光发射过程的速率常数∑k为其他有关过程的速率常数的总和,从上式可知
凡是能使k值升高而使其他k值降低的因素,都可增强荧光。一般说米,kr主要决定于化学 结构而∑k则主要决定于化学环境同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与荧光相 似。下面就讨论什么样结构的物质会发生荧光以及化学结构上的改变对其荧光强度和荧光光 谱的影响 1)跃迁类型实验表明,大多数荧光化合物都是由π→兀*或n→π*跃迁激发,然后经 过振动弛豫或其他无辐射跃迁,再发生π*→π或π*→n跃迁而产生荧光,其中π*→兀跃迁 的量子效率较高。这是由于兀→π*跃迁的摩尔吸光系数比n→π*跃迁的大100~1000倍, r→*跃迁的寿命(107-103)比n兀*跃迁的寿命(10-5103)短,因此kr值较大; 此外,在π*→兀跃迁过程中,通过系间跨越跃迁至三重态的速率常数也较小,也有利于荧光的 发射。 (2)共轭效应含有→π*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强,这种体系中的兀电 子共轭度越大,则π电子非定域性越大,越易被激发荧光也就越易发生,而且荧光光谱将向长 波移动。所以绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环;除少数高共轭体系外,能发生荧 光的脂肪族和脂环族化合物极少。任何有利于提高x电子共轭度的结构政变,都将提高荧光 效率,并使荧光波长向长波方向移动。例如表4.1和表4.2所列的对苯基化、间苯基化和乙 烯化作用都将增加苯的荧光强度,并使荧光光谱红移 41对苯基化和间苯基化作用对荧光效率以及荧光波长的影响 化合物(在环已烷中) a/nm 0.07 联苯 316 对-联三萃 0.93 对-联四苯 0.89 366 1,3,5-三苯基苯 0.27 表4,2乙烯化作用对荧光效率以及荧光波长的影响 化合物 a/nm 联苯 0.18 4-乙烯基联苯 061 蒽 0.36 9-乙烯基蒽 0.76 432 3)刚性平面结构实验发现多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光,因为 这种结构可以减少分子的振动使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小,也就减少了碰 撞去活的可能性。 试比较荧光素和酚酞的结构,尽管它们十分相似,但荧光素在溶液中有很强的荧光,而酚 酞却没有.这主要是荧光素分子中的氧桥使其具有刚性平面结构,又如芴和联苯在同样条件 下其量子效率分别为≈1和0.18,芴中的亚甲基使分子的刚性增加导致两者在荧光性质上显 著的差别
酚酞 荧光素 联苯 (4)取代基效应芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱 有很大的影响。表4.3中列出了部分取代基对苯的荧光效率和荧光波长的影响。一般说来,给 电子基团,如一OH、一OR、-NH2-CN,一NR2等,使荧光增强。因为产生了p-π共轭作用 增强了π电子共轭程度,使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大,而吸电子基团,如 COOH、一C=O、一NO2、一NO、卤素离子等,会减弱甚至会猝灭荧光。如硝基苯为非荧 光物质而苯酚、苯胶的荧光较苯强。如果将一个高原子序数的原子引人到π电子体系中去 往往会增强磷光而减弱荧光.例如,对于卤代苯,氟苯的荧光效率为0.16,氯苯为0.05,溴苯 为0.01,而碘苯则没有荧光,这是因为在原子序数较高的原子中,电子自旋和轨道运动间的 相互作用变大,更有利于电子自旋的改变,增大了系间跨越的速度,而使荧光减弱,磷光增强。 表4.3苯环取代基的荧光相对强度 化合物分子式光波长/m荧光的相对强度 CsHE 270~310 甲苯 CBHCI 丙基苯 CBHSCAH, 270~320 氟代苯 CBHF 270~320 10 氯代苯 CH,CI 275~345 7 溴代苯 CH,Br 290~380 碘代苯 CsH,I 酚离子 CgH,O 310~400 10 萃甲醚 CHOCH, 285~345 苯胺 CHNH 310~405 苯胺离子 CHNH 苯甲酸 CHCOOHI 苯 CHCN 硝基苯 CH,NO2 乙醇溶液 双取代和多取代物对非定域π电子激发的影响较难预测。但若能增加分子的平面性,例 如取代基之间能形成氢键则荧光增强;反之,则荧光减弱
4.溶液的荧光(或磷光)强度 (1)荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度1正比于吸收的光量1与荧光量子产率q d =or 又根据Ber定律 =I0-l1=l0(1-10-) l0和1分别为入射光强度和透射光强度。将此式代人上式得 t=@ 式中ε是摩尔吸光系数,是样品池的光程,c是样品浓度,而式中 e-2yh=1-2.3al-(23ae)-(-23al)2- 当Ec≤0.05时,可省略第二项后各项 e-23=1-2.3clc 则 I r=2. 3oploalc 当入射光强度l0与!一定,上式可简写为 即荧光强度与荧光物质的浓度成正比,但这种线性关系只有在极稀的溶液中,当c≤0.05时 才成立。对于较浓的溶液,由于猝灭现象和自吸收等原因,使荧光强度与浓度不呈线性关系 (2)影响荧光强度的因素 (i)溶剂对荧光强度的影响,溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应,前者 指的是溶剂的折射率和介电常数的影响;后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用,如 氢键的生成和化合作用,一般溶剂效应是普遍的而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化 学结构。特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值,往往大于一般溶剂效应所引起的影响。由 于溶质分子与溶剂分子间的作用使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱可能会有显 著的不同.有的情况下,增大溶剂的极性,将使n→π*跃迁的能量增大,π→π*跃迁的能量 减小,而导致荧光增强,荧光峰红移.8-巯基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四种不问极 性的溶剂中的情况就是一例(见表44)。但也有相反的情况,例如苯氨萘磺酸类化合物在戊醇、 丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五种醇中,随着醇的极性增大,荧光强度减小,荧光峰蓝移.因此,荧光 光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系,要看各种荧光物质与溶剂的不同而异 表448-巯基喹啉的荧光峰的位置和荧光效率与溶剂介电常数的关系 溶剂 介电常数 荧光峰λ/m 荧光效率φ 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 0.041 丙酮 0.055 410 如果溶剂和荧光物质形成了化合物,或溶剂使荧光物质的电离状态改变,则荧光峰位和强 度都会发生较大的改变。 i)温度对荧光强度的影响。温度对荧光强度的影响较敏感,因此荧光分析时一定要 控制好温度。温度上升使荧光强度下降,其中一个主要原因是分子的内部能量转化作用.当激
发分子接受额外热能时,有可能使激发能转换为基态的振动能量,随后迅速振动弛豫而丧失振 动能量。另一个原因是溶液温度下降时,介质的粘度增大,荧光物质与溶剂分子的碰撞也随之 减少。相反,随着温度上升,碰撞频率增加,使外转换的去活几率增加, 由于荧光物质在低温下荧光强度比在室温有显著的增强,为了提高灵敏度,近年来低温荧 光分析已发展成为荧光分析中的一个重要分支 Gi)溶液pH值对荧光强度的影响。带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧 光一般都与溶液的pH有关因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值.例如:在pH7~12 的溶液中苯胺以分子形式存在,会发生蓝色荧光,而在pH13的溶液中苯胺以离子 形式存在,都不发生荧光。因为化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同,因此它们的荧 光强度和荧光光谱就会有差别 金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液pH的影响.一方面pH会影响螯合 物的形成,另一方面还会影响整合物的组成因而影响它们的荧光性质。例如,镓与2,2~二 羟基偶氮苯在pH3~4的溶液中形成1:1螯合物,能发射光,而在pH6~7的溶液中则形 成非荧光性的1:2螯合物 v)内滤光作用和自吸收现象溶液中若存在着能吸收激发或荧光物质所发射光能的 物质就会使荧光减弱这种现象称为“内滤光作用”例如在1吗·cm-3的色氨酸溶液中,如 有KCr2O,存在,由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是KCr2O2的两个吸收峰吸收了色 氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光,使测得的色氨酸荧光大大降低 内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱 的长波长一端有重叠(如图43中有部分重叠)。在溶液浓度较大时,一部分荧光发射被自身 吸收,产生所谓“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度 (3)溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强 度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。荧光猝灭的形式很 多,机理也较复杂,下面讨论儿种导致荧光猝灭的主要类型 (i)碰撞猝灭。这是荧光猝灭的主要类型之一。它是指处于激发单重态的荧光分子 M与猝灭剂分子Q相碰撞,使前者以无辐射跃迁方式回到基态,产生猝灭作用。这一过程可 以表示如下 M+hv(发生荧光) M-hy-K, K (非辐射猝灭) (吸收 K,,M+热(碰撞猝灭) 当溶液中不存在猝灭剂分子Q时,经激发光照射后的激发态荧光物质分子M',其释放能 量的过程除荧光发射外,还有非辐射跃迁的竞争。在各反应达到平衡时,未加猝灭剂时的荧 光强度(l)与加人给定浓度的猝灭剂时的荧光强度()Q之比为 ( K ()o K2+K.] ueo K Ido K2+K3
式中[Q]为猝灭剂浓度,单位为mol·dm-3.K=K4/(K2|k3)称为猝灭常数。猝灭常数K 与溶液的粘度和温度有关,它们的近似关系式为K=T/200n(式中T为热力学温度,n为粘 度).可见,碰擅猝灭将随温度升高而增强,而在粘度大的溶剂中,猝灭作用较小 i)静态猝灭(又称组成化合物的猝灭).由于部分荧光物质分子M与猝灭剂分子Q 生成非荧光的配合物MQ而产生。这一过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变 i)转人三重态的猝灭,分子由于系问的跨越跃迁,由单重态跃迁至三重态。转人三重 态的分子在常温下不发光,它们在与其他分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。溶液里的溶 解氧可能对有机化合物的光产生猝灭作用,尤其是芳香烃较为显著。其原因可能就是转入 三重态的猝灭。三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞形成了单重激发态 的氧分子和三重态的荧光物质分子,使荧光猝灭 也有人认为氧和其他顺磁性气休会促进荧光物质的激发态分子系间跨越跃迁,或者是荧 光物质受到氧化,从而使荧光猝灭 iv)发生电子转移反应的猝灭,某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时,发生了电 子转移反应,因而引起荧光的猝灭。甲基蓝溶液的荧光被Fe2+离子猝灭便是一例。其他,如 I、Br,CNSˉ、S2O3等易于给出电子的阴离子,对奎宁罗丹明及荧光素钠等的荧光也会发 生猝灭作用 (v)荧光物质的自猝灭。在浓度较高的荧光物质溶液中往往会发生自猝灭现象。其原 因是单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起自猝灭,蒽和苯 的自猝灭便是一例,有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体,使它们的吸 收光谱发生变化,也引起溶液荧光强度的降低或消失 (二)荧光分析仪 用于测量荧光的仪器都有以下四个组成部件:激发光源样品池用于选择激发光波长和 荧光波长的单色器以及检测器。图45是荧光分析仪的结构示意图 第一单色器 或 滤光片 记录仪 光「第三单色湣 滤光片 检测器 图45荧光分析仪基本部件示意图 由光源发出的光经第一单色器得到所需要的激发光波长。如其强度为l0,通过样品池后, 由于一部分光能被荧光物质吸收其透射光强度减为l。荧光物质被激发后,将发射荧光。为 了消除入射光和散射光的影响荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。为消除可 能共存的其他光线的干扰如由激发光所产生的反射光 Rayleigh散射光和 Raman光,以及 为将溶液中杂质所发生的荧光滤去,以获得所需要的荧光,在样品池和检测器之间设置了第二 2
单色器。荧光作用于检测器上,得到相应的电信号,经放大后再记录下来 (1)激发光源在紫外-可见区范围,常用的光源是氤灯和高压汞灯 (2)样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成,通常用石英,形状以方形和长方形 为宜。 (3)单色器较精密的荧光分光光度计均采用光棚,有两个:第一单色器用于选择激发波 长;第二单色器用于分离出荧光发射波长。 (4)检测器荧光的强度迸常比较弱,因此要求检测器具有较高的灵敏度,一般由光电管 或光电倍增管作检测器,并与激发光成直角 (三)分子荧光分析法及其应用 【.荧光分析法的特点 1)灵敏度高与紫外-可见分光光度法比较,荧光是从入射光的直角方向检测,即在黑 背景下检测荧光的发射,所以一般来说,荧光分析的灵敏度要比紫外-可见分光光度法高2~4 个数量级,它的测定下限在01-9001·cm-3之间 用检出限来表示荧光法的灵敏度,即相对灵敏度,在实际应用中是比较方便的.一种相对 灵敏度是以喹宁在0.05mol·dm-3H2SO4溶液屮的荧光强度为标准,并定为1(荧光峰在 450nm).然后与相同浓度荧光物质的荧光强度进行比较,即可求得该物质的相对灵敏度,如 多数荧光仪器的检出限为0.05ng·cm3套宁,也有的为0005ng·cm-3奎宁。另一种灵敏 度的表示方法是以水的 Raman光的信噪比来表示,由于纯水易于获得,且便于测试,近来为 较多的厂家所采用。当水分子被光激发时,水分子蒙受暂时的畸变,在短时间内 (102-103)该分子会向各个不同方向发射出与激发波长相等的 Rayleigh光和波长略长 的 Raman光。用同一波长光线激发所产生的 Raman光波长也是一样的 (2)选择性强荧光法既能依据特征发射,又能依据特征吸收来鉴定物质。假如某几个 物质的发射光谱相似可以从激发光谱的差异把它们区分开来;而如果它们的吸收光谱相同, 则可用发射光谱将其区分 (3)试样量少和方法简便 (4)提供比较多的物理参数荧光分析法能提供包括激发光谱和发射光谱以及荧光强度 荧光效率、荧光寿命等许多物理参数。这些参数反映了分予的各种特性,能从不同角度提供被 研究的分子的信息 荧光分析法的弱点是它的应用范围还不够广泛。因为木身能发荧光的物质相对较少,用 加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质来进行分析,其数量也不是很多。另一方 面,由于荧光分析的灵敏度高测定时对环境因素敏感,干扰因素也较多。 2.定量测定方法 (1)校准曲线法荧光分析一般多采用校准曲线法,即用已知量的标准物质经过和试样一 样的处理后,配成一系列标准溶液在一定的仪器条件下测定这些溶液的荧光强度,作出校准 曲线。然后在同样的仪器条件下,测定试样溶液的荧光强度,从校准曲线上查出它们的浓度 (2)比较法如果已知某测定物质的荧光校准曲线的浓度线性范围,取已知量的荧光物 质(此量在校准曲线的线性范围之内)配成一标准溶液,测定其荧光强度。然后在同样条件下 测定试样溶液的荧光强度由标准溶液的浓度和两个溶液的荧光强度的比值,求得试样中荧光 物质的含量 93