实验一:光学显微镜的操作及细菌、藻类、原生动物及微型后生动物个体形态的观察 实验目的与要求 (1)了解普通光学显微镜的构造与功能,学习与掌握显微镜观察微生物的方法 (2)观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态,学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成,而当前 使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500-2000倍。 (一)显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分:一为机械装置,一为光学系统,这两部分很好的配合, 才能发挥显微镜的作用 转换器 机械载物台 载物台 底盘 聚光镜 (图1-4)欧林巴斯显微镜结构(1) 1、显徹镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋 等部件。 (1)镜座镜座是显微镜的基本支架,它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载 物台和镜筒,它是用来安装光学放大系统部件的基础 (2)铑筒镜筒上接接目镜,下接转换器,形成接目镜与接物镜(装在转换器下)间的暗室 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而 言的。镜筒长度的变化,不仅放大倍率随之变化,而且成像质量也受到影响。因此,使用显微镜 时,不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm,此数字标在物镜的外壳上。 3〕物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜,一般是三个接物镜(低倍、高倍、油 镜)。 Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器,可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接 通,与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统 (4)载物台载物台中央有一孔,为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器,其作用为固 定或移动标本的位置,使得镜检对象恰好位于视野中心 (5)推动器是移动标本的机械装置,它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的,好的显 微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺,构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检査标本的 某一部分,在第一次检查时,可记下纵横标尺的数值,以后按数值移动推动器,就可以找到原来 标本的位置
实验一：光学显微镜的操作及细菌、藻类、原生动物及微型后生动物个体形态的观察 一、实验目的与要求 （1） 了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2） 观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前 使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大 1500—2000 倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合， 才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋 等部件。 （1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载 物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而 言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜 时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为 160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器 物镜转换器上可安装 3—4 个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油 镜）。Nikon 显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接 通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固 定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显 微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的 某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来 标本的位置
6)粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件,老式显微镜粗螺旋向前 扭,镜头下降接近标本。新近出产的显微镜(如 Nikon显微镜)镜检时,右手向前扭载物台上升 让标本接近物镜,反之则下降,标本脱离物镜 ⑦)徽动螺旋用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距,要得到最清晰的物象,需要用微动螺旋做 进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米(100微米)。新近出产的较高档次的显微镜 的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜,聚光器,接物镜,接目镜等组成,光学系统使物体放大,形 成物体放大像。 (1)反光镜较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体,在镜座上装有反光镜。反光镜是由 平面和另一凹面的镜子组成,可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央,照明标本 不用聚光器时用凹面镜,凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时,一般都用平面镜。新近出产 的较高档次的显微镜镜座上装有光源,并有电流调节螺旋,可通过调节电流大小调节光照强度。 (2)聚光器聚光器在载物台下面,它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可 分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器,明视场聚光器有 阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和 球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高,是明视场镜检中质量最好的聚光器,但 它不适于4倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜(4×)大 视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下,其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上,以得到最 强的照明,使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节,使焦点落在被检物体上,以得 到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25m处,而其上升限度为载物台平面下方0.1mm 因此,要求使用的载玻片厚度应在0.8-1.2mm之间,否则被检样品不在焦点上,影响镜检效果 聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈,它可以开大和缩小,影响着成像的分辨力和反差,若将虹 彩光圈开放过大,超过物镜的数值孔径时,便产生光斑:若收缩虹彩光圈过小,分辨力下降,反 差增大。因此,在观察时,通过虹彩光圈的调节再把视场光阑(带有视场光阑的显微镜)开启到 视场周缘的外切处,使不在视场内的物体得不到任何光线的照明,以避免散射光的干扰。 (3〕物镜安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像,物镜成像的 质量,对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径( numerical apeature 简写为NA),每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上,数值孔径越大,物镜的性能越好。 物镜的种类很多,可从不同角度来分类 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同,可分为 ①干燥系物镜以空气为介质,如常用的40×以下的物镜,数值孔径均小于1。 ②油浸系物镜常以香柏油为介质,此物镜又叫油镜头,其放大率为90×一100×,数值 孔值大于1。 根据物镜放大率的高低,可分为: ①低倍物镜指1×-6×,NA值为0.04-0.15 ②中倍物镜指6×-25×,NA值为0.15-0.40 ③高倍物镜指25×-63×,NA值为0.35-0.95 ④油浸物镜指90×-100×,NA值为1.25-1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为 ①消色差物镜是最常用的物镜,外壳上标有“Ach”字样,该物镜可以除红光和青光形 成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用
（6）粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前 扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如 Nikon 显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升， 让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。 （7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做 进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动 0.1 毫米（100 微米）。新近出产的较高档次的显微镜 的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。 2、显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形 成物体放大像 。 （1）反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由 一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。 不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。新近出产 的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。 （2）聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚光器可 分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，明视场聚光器有 阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于 0.6 时会显示出色差和 球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视场镜检中质量最好的聚光器，但 它不适于 4 倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大 视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最 强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得 到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方 1.25mm 处，而其上升限度为载物台平面下方 0.1mm。 因此，要求使用的载玻片厚度应在 0.8—1.2mm 之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。 聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹 彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反 差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到 视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 （3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的 质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature 简写为 NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。 物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小于 1。 ②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为 90×—100×，数值 孔值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜 指 1×—6×，NA 值为 0.04—0.15； ②中倍物镜 指 6×—25×，NA 值为 0.15— 0.40； ③高倍物镜 指 25×—63×，NA 值为 0.35—0.95； ④油浸物镜 指 90×—100×，NA 值为 1.25—1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形 成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用
②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样,除能校正红、蓝、绿三色光的色差外 还能校正黄色光造成的相差,通常与补偿目镜配合使用 ③特种物镜在上述物镜基础上,为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如:带校正 环物镜,带视场光阑物镜,相差物镜,荧光物镜,无应变物镜,无罩物镜,长工作距离物镜等 目前在研究中常用的物镜还有:半复消色差物镜(FL),平场物镜(Plan),平场复消色差物镜(Plan Apo),超平场物镜( Splan,超平场复消色差物镜( Splan apo)等。 4)目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次,并把物像映入观察者的眼中。目镜 的结构较物镜简单,普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成,上端的一块透镜称“接目镜” 下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方,装有由金属制的环状光阑或叫“视 场光阑”,物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处,所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜( Huy gens eyepiece),如要进行研究用时, 般选用性能更好的目镜,如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广视场目镜(WF)。照相时选用照 相目镜(NFK) (二)光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的,单透镜成像具有像差,影响像质。由单透镜组合而成的透镜 组相当于一个凸透镜,放大作用更好 三)显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高,而且清 晰,物体放大后,能否呈现清晰的细微结构,首先取决于物镜的性能,其次为目镜和聚光 镜的性能 1、数值孔径也叫做镜口率(或开口率),简写为NA,在物镜和聚光器上都标有它们的数 值孔径,数值孔径是物镜和聚光器的主要参数,也是判断它们性能的最重要指标。数值孔 径和显微镜的各种性能有密切的关系,它与显微镜的分辨力成正比,与焦深成反比,与镜 象亮度的平方根成正比。 数值孔径可用下式表示: N. A=n. sin 式中: n—物镜与标本之间的介质析射率 a—物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角 镜口角a总是小于180°。因为空气的折射率为1,所以干燥物镜的数值孔径总是小于1, 一般为0.05—0.95:油浸物镜如用香柏油(折射率为1.515)浸没,则数值孔径最大可接近1.5。 虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率,但实际上从透镜的制造技术看,是不可 能达到这一极限的。通常在实用范围内,高级油浸物镜的最大数值孔径是1.4 几种物质的介质的折射率如下: 空气为1.0,水为1.33,玻璃为1.5,甘油为1.47,香柏油为1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图1-6 2、分辨力 可用下式表示 可见光的波长为0.4-0.7微米,平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜,则 D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到,若小于0.42
②复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差外， 还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如：带校正 环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工作距离物镜等。 目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)，平场复消色差物镜（Plan Apo）,超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（Splan Apo）等。 （4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜 的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”， 下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视 场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时，一 般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照相时选用照 相目镜（NFK）。 （二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜 组相当于一个凸透镜，放大作用更好。 （三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清 晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光 镜的性能。 1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为 N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数 值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔 径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜 象亮度的平方根成正比。 数值孔径可用下式表示： N.A=n.sin α 2 式中： n—物镜与标本之间的介质析射率 α—物镜的镜口角 所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角 度，。 镜口角α总是小于 180°。因为空气的折射率为 1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于 1， 一般为 0.05—0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为 1.515）浸没，则数值孔径最大可接近 1.5。 虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可 能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜的最大数值孔径是 1.4。 几种物质的介质的折射率如下： 空气为 1.0，水为 1.33，玻璃为 1.5，甘油为 1.47，香柏油为 1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图 1—6。 2、分辨力 D 可用下式表示： D=λ/2N.A. 可见光的波长为 0.4—0.7 微米，平均波长为 0.55 微米。若用数值孔为 0.65 的物镜，则 D=0.55 微米/2×0.65=0.42 微米。这表示被检物体在 0.42 微米以上时可被观察到，若小于 0.42
微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜,则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个 数值,均能视见。由此可见,D值愈小,分辨力愈高,物象愈清楚。根据上式,可通过:(1 减低波长:(2)增大折射率:(3)加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显 微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密 切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象 3、放大率: 显微镜放大物体,首先经过物镜第一次放大造象,目镜在明视距离造成第二次放大象。放 大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此,显微镜的放大率(V)等于物镜放大率 (V1)和目镜放大率(V2)的乘积,即: V=V1×V2 比较精确的计算方法,可从下列公式求得 F1=接物镜焦距,F2=接目镜焦距△=光学筒长,D=明视距离(=250毫米) 接物镜的放大倍 目镜放大倍 M=显微镜放大倍 数 设△=160毫米F1=4毫米D=250毫米F2=150毫米 则 =40×16.7=668倍 焦深 在显微镜下观察一个标本时,焦点对在某一象面时,物象最清晰,这象面为目的面。在视 野内除目的面外,还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象,这两个面之间的距离称为焦深。 物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比:即数值孔径和放大率愈大,焦深愈小。因此调节油镜比 调节低倍镜要更加仔细,否则容易使物象滑过而找不到 三、实验器材 1.显微镜、擦镜纸等 2.标本片 3.香柏油、二甲苯 四、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密,使用时必须细心,要按下述操作步骤进行。 (一)观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿岀时,要用右手紧握镜臂,左手托住镜座,平稳地将显 微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方,离桌子边缘约10cm左右,右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照不带光源的显微镜,可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照,但不能用 直射阳光,直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛
微米就不能视见。如果使用数值孔径为 1.25 的物镜，则 D=2.20 微米。凡被检物体长度大于这个 数值，均能视见。由此可见，D 值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1） 减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显 微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密 切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3、放大率： 显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放 大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率 （V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即： V=V1×V2 比较精确的计算方法，可从下列公式求得 M = △ × D F 1 F 2 F1=接物镜焦距，F2=接目镜焦距 △=光学筒长，D=明视距离（=250 毫米） △ =接物镜的放大倍 数 D =接目镜放大倍 数 M=显微镜放大倍 数 F 1 F 2 设△=160 毫米 F1=4 毫米 D=250 毫米 F2=150 毫米 则 M= △ × D = 1 60 × 2 50 =40×16.7=668 倍 F 1 F 2 4 1 5 4、焦深： 在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视 野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。 物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比 调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。 三、实验器材 1. 显微镜、擦镜纸等 2. 标本片 3. 香柏油、二甲苯 四、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 （一）观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显 微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约 10cm 左右，右侧可放记录本或绘图纸。 3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用 直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛
将10×物镜转入光孔,将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置,用左眼观察目镜中视野的 亮度,转动反光镜,使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时,用平面反光镜,光线较 弱时,用凹面反光镜。自带光源的显微镜,可通过调节电流旋钮来调节光照强弱 4、调节光轴中心显微镜在观察时,其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及 光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜,先将光阑缩小,用10× 物镜观察,在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像,如此像不在视场中央,可利用聚光器 外侧的两个调整旋钮将其调到中央,然后缓慢地将视场光阑打开,能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接,说明光线已经合轴 切忌用单手拎提;且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察,以减少眼 晴疲劳,也便于边观察边绘图或记录 (二)低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大, 易于发现目标和确定检查的位置 将标本片放置在载物台上,用标本夹夹住,移动推动器,使被观察的标本处在物镜正下方 转动粗调节旋钮,使物镜调至接近标本处,用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒(或下 降载物台),直至物像出现,再用细调节旋钮使物像淸晰为止。用推动器移动标本片,找到合适 的目的像并将它移到视野中央进行观察 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时,必需养成先从侧面注视小心调节物镜近标本,然 后用目镜观察,慢慢调节物镜高开标本进行准焦的习惯,以兔因一时的误操作而损坏镜头及玻 片 〔三)高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜,低倍、高倍镜头 是同焦的,在正常情况下,高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的 物镜,在转换物镜时要从侧面观察,避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察,调节光照,使亮度 适中,缓慢调节粗调节旋钮,使载物台上升(或镜筒下降),直至物像出现,再用细调节旋钮调 至物像清晰为止,找到需观察的部位,并移至视野中央进行观察。 在一般情况下,当物像在一种物镜中已清晰聚焦后,转动物镜转换器将其他物镜转到工作 位置进行观察时,物像将保持基本准焦的状态,这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象 可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距高短的物镜时仅用细训节器即可对物像清 晰聚焦,从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 四)油镜親察油浸物镜的工作距离(指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离)很短, 般在0.2mm以内,再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”,因此使用油浸物镜时 要特别细心,避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作: 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升(或将载物台下降)约2c皿,并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油 3、从侧面注视,用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升,(或镜筒下降),使油浸物镜浸入香柏油 中,使镜头几乎与标本接触 4、从接目镜内观察,放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈(带视场光阑油镜开大视场光阑) 上调聚光器,使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降(或镜筒上升),当出现物像」 闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象,必须再从侧面观察, 重复上述操作。 有时按上述操作还找不到目的物,则可能是由于油镜头下降还未到位,或因油镜上升太快 以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况,应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜 头时用力过猛,或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片
将 10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的 亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较 弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。 4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及 光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用 10× 物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器 外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼 睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。 （二）低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大， 易于发现目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方， 转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下 降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适 的目的像并将它移到视野中央进行观察。 在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然 后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻 片。 （三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头 是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的 物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度 适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调 至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作 位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象， 可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清 晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 （四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短， 一般在 0.2mm 以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时 要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 使用油镜按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约 2cm，并将高倍镜转出。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油 中，使镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑）， 上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一 闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察， 重复上述操作。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快。 以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜 头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片
5、观察完毕,下降载物台,将油镜头转出,先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用擦镜纸蘸少许乙 醚酒精混合液(乙醚Σ份,纯酒精3份)或二甲苯,擦去镜头上残留油迹,最后再用擦镜纸擦拭 2-3下即可,(注意向一个方向擦拭) 6、将各部分还原,转动物镜转换器,使物镜头不与载物台通光孔相对,而是成八字形位置,再 将镜筒下降至最低,降下聚光器,反光镜与聚光器垂直,用一个干净手帕将接目镜罩好,以免目 镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分,然后将显微镜放回柜内或镜箱中 7、有菌的玻片置消毒缸中,清洗、晾干后备用。 五、实验报告 1、结果 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的标本片的形态,包括在三种情况下视野中的 变化,同时注明物镜放大倍数和总放大率 2、思考题 (1)用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用? (2)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别 注意避免粗调节器的误操作? (3)什么是物镜的同焦现象?它在显微镜观察中有什么意义? (4)影响显微镜分辨率的因素有哪些? (5)根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效的 观察
5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙 醚酒精混合液（乙醚 2 份，纯酒精 3 份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭 2—3 下即可，（注意向一个方向擦拭）。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再 将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目 镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 7、有菌的玻片置消毒缸中，清洗、晾干后备用。 五、实验报告 1、结果 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的标本片的形态，包括在三种情况下视野中的 变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。 2、思考题 (1)用油镜观察时应注意哪些问题?在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用? (2)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别 注意避免粗调节器的误操作? (3)什么是物镜的同焦现象?它在显微镜观察中有什么意义? (4)影响显微镜分辨率的因素有哪些？ (5)根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的 观察
