实验六:卫生细菌的检验一大肠菌群的测定 实验目的与要求: (1)学习并掌握水体中大肠菌群的检验方法、检验的原理、检验的依据、数据处理和报 告方法。 (2)强化水体大肠菌群检验的卫生意义知识。 、实验原理 大肠菌群系指一群在37℃,24小时能发酵乳糖、产酸、产气,需氧或兼性厌氧的革兰 氏阴性无芽孢杆菌。该菌中大肠菌群数是以每100毫升(克)检样内大肠菌群最可能数(MPN) 表示。 、仪器及材料 1、乳糖蛋白胨培养液 1.1成份 A蛋白胨 B牛肉膏 3g C乳糖 D氯化钠 E溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) F蒸馏水 1000mL 12制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中,调整pH为7.2-7.4,再加入 lmL溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L),充分混匀,分装于装有倒管的试管中,115℃高压灭菌20min, 储存于冷暗处备用。 2、二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液除蒸馏水外,其它成份量加倍。 3、伊红美蓝培养基 3.1成份 A蛋白胨 B乳糖 C磷酸氢二 D琼脂 E蒸馏水 1000mL F伊红水溶液(20g/L 20mL G美蓝水溶液(5g/L) 32制法:将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正pH为72,加入乳糖 混匀后分装,以115℃ 高压灭菌2min。临用时加热熔化琼脂,冷至50~55℃,加入伊红和美蓝溶液, 混匀,倾注平皿 4、革兰氏染色液 4.1结晶紫染色液 A.成份 结晶紫 b乙醇[p(C2H2OHj=95% 20mL c草酸铵水溶液(10g/L) 80mL B制法:将结晶紫溶于乙醇p(C2H2OH)]=95%中,然后与草酸铵溶液混合。 注:结晶紫不可用龙胆紫代替,前者是纯品,后者不是单一成份,易出现假阳性。 结晶紫溶液放置过久会产生沉淀,不能再用, 42革兰氏碘液 A成份 碘片
实验六：卫生细菌的检验—大肠菌群的测定 一、实验目的与要求： （1） 学习并掌握水体中大肠菌群的检验方法、检验的原理、检验的依据、数据处理和报 告方法。 （2） 强化水体大肠菌群检验的卫生意义知识。 二、实验原理 大肠菌群系指一群在 37℃，24 小时能发酵乳糖、产酸、产气，需氧或兼性厌氧的革兰 氏阴性无芽孢杆菌。该菌中大肠菌群数是以每 100 毫升（克）检样内大肠菌群最可能数（MPN） 表示。 三、仪器及材料 1、乳糖蛋白胨培养液 1.1 成份 A 蛋白胨 10g B 牛肉膏 3g C 乳糖 5g D 氯化钠 5g E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL F 蒸馏水 1000mL 1.2 制法 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整 pH 为 7.2~7.4，再加入 1mL溴甲酚紫乙醇溶液（16g/L），充分混匀，分装于装有倒管的试管中，115℃高压灭菌20min， 储存于冷暗处备用。 2、二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液除蒸馏水外，其它成份量加倍。 3、伊红美蓝培养基 3.1 成份 A 蛋白胨 10g B 乳糖 3g C 磷酸氢二钾 5g D 琼脂 5g E 蒸馏水 1000mL F 伊红水溶液(20g/L) 20mL G 美蓝水溶液(5g/L) 13mL 3.2 制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正 pH 为 7.2，加入乳糖， 混匀后分装，以 115℃ 高压灭菌 20min。临用时加热熔化琼脂，冷至 50~55℃，加入伊红和美蓝溶液， 混匀，倾注平皿。 4、革兰氏染色液 4.1 结晶紫染色液 A. 成份 a 结晶紫 1g b 乙醇[ p （C2H2OH）]=95% 20mL c 草酸铵水溶液（10g/L） 80mL B 制法：将结晶紫溶于乙醇[ p （C2H2OH）]=95%中，然后与草酸铵溶液混合。 注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成份，易出现假阳性。 结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。 4.2 革兰氏碘液 A 成份 碘片 1g
碘化钾 蒸馏水 300mL B制法:将碘和碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后, 再加蒸馏水 43脱色剂:乙醇[p(C2H2OH)}=95% 44沙黄复染液 A成份 a沙黄 0.25g b乙醇[p(C2H2OH)]=95% c蒸馏水 B制法:将沙黄溶解于乙醇中,待完全溶解后加入蒸馏水 注:如沙黄买不到,可用苯酚复红染色液(1+10),作复染液,复染时间为10s 仪器设备 1培养箱:36±1℃ 2冰箱:04℃ 3天平 4显微镜 5平皿:直径为9cm 6试管 7分度吸管:1mL,10mL 8锥形瓶 9小倒管 10载玻片 四、实验内容 1、检验生活饮用水时,取l0mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中,取1mL 水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中,另取lmL水样注入到‰mL灭菌生理盐水中, 混匀后吸取1mL(即0.lmL水样)注入到l0mL单料乳糖蛋白胨培养液中,每一稀释度共 接种5管。对已处理过的出厂自来水,需经常检验或每天检验一次的,可直接种5份10mL 双料培养基,每份接种10mL水样。 2、检验水源水时,如污染较严重,应加大稀释度,可接种1,1.0,001mL甚至0.1, 0.01,o00lmL。每个稀释度接种5管,每个水样接种15管。接种1mL以下水样时,必须 作10倍递增稀释后,取lmL接种。每递增稀释一次,换用1支lmL灭菌分度吸管 3、将接种管置36±1℃培养箱内,培养24±2h,如所有乳糖蛋白胨培训管都不产气产 酸,则可报告为总大肠菌群阴性,如有产酸产气者,则按下列步骤进行 4、分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,于36±1℃培养箱内培养18 24h,观察菌落形态,挑取符合下列特征的菌落: 深紫黑色,具有金属光泽的菌落 紫黑色,不带或略带金属光泽的菌落。 淡紫红色,中心较深的菌落。 作革兰氏染色、镜检和证实试验 5、证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杄菌,同时接种乳糖蛋白胨培养液,置36±1℃培 养箱中培养24±2h,有产酸产气者,即证实有总大肠菌群存在。 五、实验报告 根据证实为大肠菌群阳性管数,查MPN检索表。报告每100毫升(克)样品中大肠菌 群的最近似值。 大肠菌群检验程序 表150毫升检样接种1管、10毫升、1毫升检样各接处3管的大肠杆菌最近似数检索表 50m管阳性数 l0ml管阳性数 lml管阳性数 每100ml的MPN
碘化钾 2g 蒸馏水 300mL B 制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后， 再加蒸馏水。 4.3 脱色剂：乙醇[ p （C2H2OH）]=95%。 4.4 沙黄复染液 A 成份 a 沙黄 0.25g b 乙醇[ p （C2H2OH）]=95% 10mL c 蒸馏水 90mL B 制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。 注：如沙黄买不到，可用苯酚复红染色液（1+10），作复染液，复染时间为 10s。 仪器设备 1 培养箱：36±1℃ 2 冰箱：0~4℃ 3 天平 4 显微镜 5 平皿：直径为 9cm 6 试管 7 分度吸管：1mL，10mL 8 锥形瓶 9 小倒管 10 载玻片 四、实验内容 1、检验生活饮用水时，取 10mL 水样接种到 10mL 双料乳糖蛋白胨培养液中，取 1mL 水样接种到 10mL 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取 1mL 水样注入到 9mL 灭菌生理盐水中， 混匀后吸取 1mL（即 0.1mL 水样）注入到 10mL 单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度共 接种 5 管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种 5 份 10mL 双料培养基，每份接种 10mL 水样。 2、检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种 1，1.0,0.01mL 甚至 0.1， 0.01，0.001mL。每个稀释度接种 5 管，每个水样接种 15 管。接种 1mL 以下水样时，必须 作 10 倍递增稀释后，取 1mL 接种。每递增稀释一次，换用 1 支 1mL 灭菌分度吸管。 3、将接种管置 36±1℃培养箱内，培养 24±2h，如所有乳糖蛋白胨培训管都不产气产 酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。 4、分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于 36±1℃培养箱内培养 18— 24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落。 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。 淡紫红色，中心较深的菌落。 作革兰氏染色、镜检和证实试验。 5、证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置 36±1℃培 养箱中培养 24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。 五、实验报告 根据证实为大肠菌群阳性管数，查 MPN 检索表。报告每 100 毫升（克）样品中大肠菌 群的最近似值。 大肠菌群检验程序 表 1 50 毫升检样接种 1 管、10 毫升、1 毫升检样各接处 3 管的大肠杆菌最近似数检索表 50ml 管阳性数 10ml 管阳性数 1ml 管阳性数 每 100ml 的 MPN
0 000000000000 0120 2223330000111 0120120 1230123 223 230 7957028 表2:10毫升、1毫升、0.1毫升检样各接种3管的大肠杆菌最近似数(每100毫升) 检索表 阳性管 N MPN MPN 10ml Iml 0.1ml 10ml Iml 0.Iml 10ml 0.Iml 000 22 30 00000000000000 12301230123012 P36936926926936 150460 0000 523 339453500 12222333 11222222 223333000011 0123012301230 4994065 23333333333333 22223 012301230 472695 10
0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 2 2 0 1 0 1 0 1 1 2 0 1 2 3 0 2 0 2 0 2 1 3 0 2 2 4 0 3 0 3 0 3 1 5 0 3 2 6 1 0 0 1 1 0 1 3 1 0 2 4 1 0 3 6 1 1 0 3 1 1 1 5 1 1 2 7 1 1 3 9 1 2 0 5 1 2 1 7 1 2 2 10 1 2 3 12 1 3 0 8 表 2：10 毫升、1 毫升、0.1 毫升检样各接种 3 管的大肠杆菌最近似数（每 100 毫升） 检索表。 阳性管 MPN 阳性管 MPN 阳性管 MPN 10ml 1ml 0.1ml 10ml 1ml 0.1ml 10ml 1ml 0.1ml 0 0 1 3 1 2 0 11 2 3 3 53 0 0 2 6 1 2 1 15 3 0 0 23 0 0 3 9 1 2 2 20 3 0 1 39 0 1 0 3 1 2 3 24 3 0 2 64 0 1 1 6 1 3 0 16 3 0 3 95 0 1 2 9 1 3 1 20 3 1 0 43 0 1 3 12 1 3 2 24 3 1 1 75 0 2 0 6 1 3 3 29 3 1 2 120 0 2 1 9 2 0 0 9 3 1 3 160 0 2 2 12 2 0 1 14 3 2 0 93 0 2 3 16 2 0 2 20 3 2 1 150 0 3 0 9 2 0 3 26 3 2 2 210 0 3 1 13 2 1 0 15 3 2 3 290 0 3 2 16 2 1 1 20 3 3 0 240
0 3 3 460 3 2 00 301230123 947 222222222 222333 230123012 35 57159 36
0 3 3 19 2 1 2 27 3 3 1 460 1 0 0 4 2 1 3 34 3 3 2 1100 1 0 1 7 2 2 0 21 3 3 3 1100+ 1 0 2 11 2 2 1 28 1 0 3 15 2 2 2 35 1 1 0 7 2 2 3 42 1 1 1 11 2 3 0 29 1 1 2 15 2 3 1 36 1 1 3 19 2 3 2 44