位器分析堂验《第二版)教材《复甘大学出饭社)补充内容 补充讲义毛细管电泳实验 一、目的要求 1、熟悉手细管申泳的基本原理和某本想多 2、了解毛细管电仪的组成，熟练掌握毛细管电泳仪的使用方法， 内容提要 电泳(electrophoresis)作为一类分离技术，是依据溶质在电场中不同的迁移速率来进行 的。其中，毛细管电泳(capillary。 css.CE)是泛指在内径小于100m的毛细 内实现的一类电泳技术。 一般认为毛细管电泳里程碑式的工作是由Jo 1981年完成的，他们使用75的毛细管柱，用电迁移进样和荧光检测器对多种组分实现 了分离。毛细管电泳是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物，实际上包含电泳、色遇 及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微 弃水平非入纳升水平 在缓冲液中，带电拉子在直流电场的作用下，以不 同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，这就是电迁 毛管内婴 移，道常称为电泳。单位电场(E)下的电泳速度(vE) 通微致里当度兴由子堂实。户作我门有在物卫明化 学手册中可以查到的离千消度常数是绝对淌度，在电泳 实验中测定的值往往与此不同，我们将实验值称为有效 消度（山） 在水溶液中多数固体表面根据材料性质的不同带 有过剩的负电荷或正电荷，以石英毛细管柱为例，当它 与电解质溶液接触时，在DH>3的情况下，其内表面 的陆影其媒离并，产生表而负电物，此负电荷随即暖吸引溶 双电 5由的正离子，形成双由早。夏由是中察一测的正 图1毛细管壁双电层结构示意图 子浓音高干溶液本体中，并是度分布《日图1)，用 资成层不可以讲一北分为吸附层和扩散层。前者在申泳过程中不会移动，后者在高压由场的 作用k.由于培正由而向备好方白载动形成由滤流《elect0 osmotic flow,EOF).由卷 的大小可以也用淌度（或称为电渗流系数）来表示，。=vE,v为电渗流速度、E为电场 带电粒子在毛细管缓神液中的迁移速度等于电泳消度和电参淌度的矢量和，称为表观湍 度（apparent mobilit),L=Le+ 一情况下，电海流的速度比电泳速度快5？倍 故当离子的电泳淌度方向与电渗流方向相反时，仍然可以使其沿电渗流方向迁移。各种粒子 由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同 等因素引起迁移速度不同而实现分离 平面流四 由热是推动样品开移的个重要动力，由 发流的，个重要特性是具有平面流型。由于 起流动的推动力在毛细管的径向上均匀分布 所以管内冬处流速接近相等其优占是径面打 收对兽带属的影血非常小，如图2所示。与 此形成鲜明对照的是高压泵驱动的物物线活 型（如在HPLC中），由于管内径向上各处的 点速不同，使很棉带蜂形变窗。这也品与 (a)电渗流驱动 (b)高压现是动 HP工C相比，CE具有更高分离效率的个重 要原因。 图2不同驱动力的流型（上）和相应的谱带蜂形（下 毛细管区带电泳(CZ正)是最简单的CE 模式，因为毛细管中的分离介质只是缓冲液。 1
仪器分析实验（第二板）教材（复旦大学出版社）补充内容 由于电渗流的作用，正负离子均可以实现分离。在正极进样的情况下，正离子首先流出毛细 管，负离子最后流出。中性物质在电场中不迁移，只是随电渗流一起流出毛细管，故得不到 分离 在CZE中， 影响分离的因素主要有缓冲液的种类、浓度和pH值、 添知剂、分析电 温度 毛细管的尺寸和内壁改性等。缓冲液种类的选择主要考虑其pK值要与分析所用p正 匹配 另外 有的缓冲液与样品组分之有特殊的相互作用，可提高分析透择性 比如，分 化合物时，多用酸缓冲液，因为酸根可与羟基形成络合物，有利于提高分离效 率。增大缓冲液的浓度 可以改善分离，但电漫流会降低，因而延长了分析时间 盐浓度还 :州加焦耳热。 缓冲液的主要影响电渗流的大小和被分析物的解离情况 影响被分析物的度，是CZE分析中最重要的操作参数 缓冲液添加剂多为有机试 乙睛、尿素 三乙胺等，其作用主要是增加样品在缓冲液中的溶解度，抑制样品到 分在 管壁的吸附，改善峰形 。提高分析电压有利于提高分离效率和缩短分析时间， 能造成过大的焦耳热 度的变化可以改变缓冲液的粘度，从而影响电渗 毛细管内径超 分离效 率越高，但样品容量越低：增加毛细管！ 可提高分效率，但延长了分析时间 有时为了改善分离， 对毛细管内壁近行改性，比如采用徐层技术 CZE模式下，淌度的计算公式为 (单位：m2.-s1 其中 1即被分析物质从进样口迁移到检测点所经过的距离。 L为毛细管总长度：V 为所加的电压：为样品的保留时 然后求得被分析物的表观消度 0m的数毛管中聚合 消除毛细管内痒 蛋白质的吸附 并利 种万 gel elec E电 984 人毛细管电泳来分离 中性组分 重要分支 MEKC) 98 Hjerten和Zhu把传统的等电聚焦过程转移到 等电聚 0e0 质便可能得到分两 了毛细管电色(Capillary hy),进一步扩大了电冰的应月 范围 截至日前，常见的电泳基本榄式如下表所示 表1.八种CE分离模式 分离模式 分离依据 说明 毛细管区带电泳(CZE) 溶质在自由溶液中的清度差异 毛细管内只填充缓冲礼 胶束电动毛细管色游 溶质在胶束与水相间分配系数在CZE缓冲液中加入表面活性 (MEKC) 的异 剂使成胶束 微乳液电动毛细管色谱 整与水相间分配系 使用水包油缓冲液体系 毛细管凝胶电冰(CGE》 质分子大小与电质量比 管内填充聚丙烯酰胺等凝胶 毛细管等电聚焦(CEF) 等电点差异 管内填充pH梯度的介质 毛细管等速电泳(CITP 用不连续（自由溶液） .2-
仪器分析实验（第二版）教材（复旦大学出版社）补充内容 毛细管电色谱(CEC) 电渗流驱动的色谱分离机制 要指出的是，关于毛细管电泳的分类并无严格规定，比如可以按照溶剂的性质分为水 和非水毛细管电泳：按熙毛细管数日的多寡分为根 照 在实验操作中是否加压，还有加压毛细管电色谱等。另外毛细管电泳还可以于质清、 磁共 细管电泳的 、林炳承等教授于上世纪八十年代开好 年， 科院化学 电泳学术研讨 每两年举有们 CE的检出灵敏度和精 不及HPL CE具有如下优。 的生物人。 得CE的理论塔 系数成正出 对扩散系数 CL HP 百万乃至几 HP 般为几千到儿) 2 用移 司取代HPLC 中的保留时 ,CE的分析时 通常不超过30mm 光HPLC所的 ,例如有在250s内分离10种蛋日 1.7m血内分离19种阳离 30种 )微量：CE需要的样品量为纳升量级，而HPLC所 高防样品景为微升量级，仅为HP 的干分 操作模式多 分离方法】 要换毛细管内填充溶液的种类、浓度 酸度或添加剂 儿开 毫升乃 J能力，使CE成为近年习 湾的 分 细管电泳仪未曾商品化 的贝 都是各 己装配的 19 9年贝克曼库尔 国产化的 毛细管 测器 电化学 石英毛细管和紫外 光 领域 应用，可以用为 、无机离 、蛋白质、氨基酸等等 实验选择有利 机阴离 厨离子 t、Br C0,2等)对紫外光儿乎没有吸收能力，因此需要使用 接紫外检 法检出这些离了 ,在实验中述用对紫外光具有较吸收能力的C0作为缓冲剂 因为铬酸根可提供强紫外吸收背景，当没有紫外吸收能力的待测离子取代了带有相同电荷的 洛酸根时，就会相应地检测到一个倒峰：另一方面是因为其清度与待测离子的淌度接近，因 而可得到比较对称的电泳峰。 用毛细管电泳分离阴离子时，若采用正极进样、负极端检测时，电渗流方向与阴离子运 动方向相反，致使一些电泳消度大的阴离子无法达到检测端。为了解决这个问题，在缓冲溶 液中加入少量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为电渗流改性剂，通过CTAB在毛细管 上的吸附，使原本由正极流向负极的电渗流的方向变为由负极流向正极，这样可以提高分析 速度，并得到较好的峰形。阴离子的实际淌度通常不受缓冲溶液的H值和电渗流改性剂浓 度的影响，但其大小与缓冲溶液离子强度有关。 三.仪器和试剂 3-
仪器分析实验（第二版）教材（复且大学出版社）补充内容 仪暴：CL1020高效毛细管电冰仪，配有正负可遇稳压电源（北京彩陆科学仪器有限公司） 石英毛细管(50mid,360m0.d,有效长度41cm实际长度50c:河北水年锐津色谱 器件有限公司) 1mL、100移器 过 .1 mol/L NaOH溶液、0.1 moV/L HCI溶液 步骤一所用试制 50 60 90 100 6 55.0 810 030 0.2 mol/L POa(mL) 90. 73.5 45.0 19.0 mgmL步不 、1mgmL间硝基米盼、1mgmL对硝基养畅 步骤（二）所用试剂 缓冲溶液：含20 mmoVL曜砂、20mmoL铬酸钾和0.1 nuoVLCTAB 0.5molL的CT、Br、NO,、S0:,Co储备液 待测样品：自来水、矿泉水等 四.实验步骤 (一)有机化合物的毛细管区带电泳(CZE)定性分析 1.打开电脑及HW3000软件，打开监测器开关、柱箱风扇开关和高压电源开关：设定检测 波长为254m。分离电压20kV(正极进样). 2.在每次分高之前，分别用0.1 M NaOH、蒸馏水、0.1MHC1,蒸馏水清洗毛细管2min, 再用分离缓冲液平衡毛细管5m血：冲洗过程中毛细管出口对准废液瓶。 3.用pH7.9的20moL鳞酸缓冲液做电泳缓冲液，分别对邻硝基苯酚、间硝基苯酚和对 硝基养酚进样分析，进样时间：5s(重力进样)，确定各组分的保留时间。 4.配制并分析混合样。 5.依次改变分离电压为10、15、20、25kV,考察分离电压的改变对保留时间的影响 6.分离电压20V的条件下，依次改变电冰缓冲液的H值为59、64、69、7.4、79，考 察pH值对保留时间的影响。（注：酸形无色） (二)无机阴离子的毛细管电泳分析（间接紫外检测法） 1.打开电脑及H30O0软件，打开监测器开关、柱箱风扇开关和高压电源开关：设定检测 波长为254m 分离电压20kV(负极进样 2.在每次分离之前，分别用0.1 M NaOH、蒸馏水、0.1MHC1、蒸水清洗毛细管2mim 再用分离缓冲液 衡毛细管5mi 3.分别移取储各波010 35050079 度分 用去离子水稀稀 至刻度，配 为 5.0、75、10.0mo1L的系列标准液，用于测定 标准曲线。 要内标物 如 分别对系 进样时间：5s(重力进样)。确定各组分的保留时间。并绘制标准曲线 取自来水样进行分析 五、数据处 1、记录毛细管电泳的操作条件。包括：仪器型号、检测器类型、柱类型、柱长、分离 电压、保留时问等 2,绘制pH值对邻确基养粉、间硝基米粉和对硝基苯酚有效淌度的影响曲线。 、绘制C1、Br、C0,等离子的标准曲线，求出自米水中离子的浓度 六、附录 4
仪器分析实验（第二板）材（复且大学出版社）补充内容 高压电 据实验要求择正极或负极进样，在电源后插座线上选择相 的 插并 电机按缸 开启电源之后 上角会亮起正极或负极的灯 ,表示相应的 以进样工 之后设置相应电压条件， “组次” 设定相应的电 ,时间和最大电 流量，设置好按下 “佣足。攻下 “选择”，选择才设置好的“组次 电压准备就绪 2.毛细管电泳检测池：打开仓门可以看到内部的样品池和紫外检测区。先打开仓 下部的风扇，尽量驱散毛细管安培热的影响。在注射器内加入NOH溶液或者缓冲液，用 注射的方法可以清洗毛细管。高压检测时要注意使电极和毛细管深入缓冲液面以下。「吸遗 样的样品槽在里而的支架上，只有关闭仓门，高压电源才可以正常工作 3.紫外检测器：开机需要预热，主要用到的功能是选择紫外检测器的波长，按“WL 键选择相应的波长，按“ENTER”.注意每次重新开机，波长都会回到初始值254m 4.色谱工作站软件Hw-2000:打开数据采集器的开关，之后打开色谱工作站软件 HW-2000(通用版)。当高压电源打开之后，一般忽略开始的10s,之后运行软件，可以按下 连接在数据采集器上的绿色按钮，也可以在色谱工作站软件界面中点击绿色开始按钮，随者 电冰曲线的出现，出现了全部的峰后，直到基线走平没有残留物质，则可以停止检测、关闭 高压 5进出口装有缓冲液的试剂瓶中液面要求平齐，避兔给分析带来人为的液压差 6.实验结束后，用去离子水清洗毛细管3m再用空气冲洗5mm以免残留的缓 液堵塞毛细管 (二)可能遇到的问题： 。电流显示过小 要重新用0.1molL 往往电流显示小于10A,就很可能是毛细管内部堵，这样就 OH溶液等清洗毛 训管 分 意这些问题的 往和实验结束没有 用N 上意 关操 毛 以俱 下窗方法如下 用标尺选定 的有效长 ,这样毛细管的窗口处就变成无色 记号处用 将老 小心伸入紫外检测器的零件 光观察是 毛细管窗口处正好对准检测器的透光口，对准之后安装好仪器就可以使用了 七、思考购 1、根据邻硝基酚 。间硝基米酚和对基米酚的酸碱解离常数，解释其出峰次序。 2、简述毛细管电泳与高效液相色谱的特点和应用范围 3、毛细管电泳如需分离蛋白质类样品，试预测将会面临什么问题，试提出解决方案 参考资 [1]Jorgenson J.W..Lukaes K.D..Anal.Chemt..1981.53:1298 D1 Hierten sI Chmma 0m1083.270-1.6 [3]Temabe.S.Tsuka.K.Iehikawa.K etal 4mal.Chem.1984.56(1):111-113. 10发g346268.390 S1陈义，《毛细管电冰技术及应用（第二板》，北京：化学工业出板壮，20心6 问张样民，《现代色分析，上海：复旦大学出版社，2004 陈培。李景虹.邓物，《现代仪器分析实验与技术第二版)》，北京：清华大学出饭社，2006 [图卢期，学士论文，高效毛细管电泳的教学实验设计，上海：复且大学，2009. 实哈仍在完善中，请大家多提宝贵意见，谢谢 雷杰 20100205 5-