第二十二章金免疫技术 Chapter22 colloidal gold immunoassay technique 第一节胶体金与免疫金制备(preparations of colloidal gold and immunogold) 一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存 第二节金免疫测定技术(colloidal gold immunoassay) 一、斑点金免疫渗滤试验 二、斑点金免疫层析试验 三、临床应用及评价 第三节金免疫组织化学染色技术(colloidal gold immunohistochemistry staining technique) 一、免疫金（银）光镜染色技术 二、免疫金电镜染色技术 三、临床应用与评价 学习要点 胶体金和免疫金制备 胶体金免疫层析试验 。胶体金免疫渗滤试验 临床应用与评价 学习要点 金免疫技术主要有金免疫测定技术和金免疫组织化学染色技术两种类型，其中金免疫测 定技术因其简便、快速而被广泛应用于抗原或抗体定性检测，成为“床边检验”主要方法之 一。本章主要介绍了胶体金和免疫金制备和及其特性、金免疫测定技术和金免疫组织化学染 色技术的原理和技术类型及技术要点。重点掌握金免疫测定技术的类型和相应原理、技术类 型和临床应用。 金免疫技术(colloidal gold immunoassay technique)是一种以胶体金作为标记物 的免疫标记技术，于70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。目前
第二十二章 金免疫技术 Chapter22 colloidal gold immunoassay technique 第一节 胶体金与免疫金制备(preparations of colloidal gold and immunogold) 一、胶体金特性及其制备 二、免疫金的制备 三、免疫金的保存 第二节 金免疫测定技术 (colloidal gold immunoassay) 一、斑点金免疫渗滤试验 二、斑点金免疫层析试验 三、临床应用及评价 第三节 金免疫组织化学染色技术(colloidal gold immunohistochemistry staining technique) 一、免疫金(银)光镜染色技术 二、免疫金电镜染色技术 三、临床应用与评价 学习要点 ⚫ 胶体金和免疫金制备 ⚫ 胶体金免疫层析试验 ⚫ 胶体金免疫渗滤试验 ⚫ 临床应用与评价 学习要点 金免疫技术主要有金免疫测定技术和金免疫组织化学染色技术两种类型，其中金免疫测 定技术因其简便、快速而被广泛应用于抗原或抗体定性检测，成为“床边检验”主要方法之 一。本章主要介绍了胶体金和免疫金制备和及其特性、金免疫测定技术和金免疫组织化学染 色技术的原理和技术类型及技术要点。重点掌握金免疫测定技术的类型和相应原理、技术类 型和临床应用。 金免疫技术（colloidal gold immunoassay technique）是一种以胶体金作为标记物 的免疫标记技术，于 70 年代初期由 Faulk 和 Taylor 始创，最初用于免疫电镜技术。目前
金免疫技术除用于免疫组织化学染色外，还应用于金免疫测定中，由于金标记常与膜载体配 合，形成特定的测定模式，典型的如斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等，方法简 便、快速，是目前应用广泛的检验方法。 金免疫技术主要有金免疫组织化学染色技术和金免疫测定技术，前者包括金（银） 免疫光镜染色技术和金免疫电镜染色技术：后者包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析 试验等。 第一节胶体金与免疫金的制备 一、胶体金特性及其制备 (一)胶体金的结构 胶体金(colloidal gold)也称金溶胶(gold solution),是金盐被还原成金原子后 形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（金原子Au)及包围在外的双离子层构成， 紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12ˉ)，外层离子层T则分散在胶体间溶液中，以维持 胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大 的胶体金颗粒（一般指大于30m以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗 粒形态。 (二)胶体金性状 1.胶体金一般性质胶体金颗粒大小多在1~100nm,微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单 一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电 解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态，使分 散的单一金颗粒凝聚成大颗粒而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体 金、加强其稳定性的作用。 影响胶体金溶液稳定性的主要因素有：①胶体金胶粒间的相互吸引力，当胶粒相距很近 时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大：②水化层的带电情况，一种溶胶的各个胶粒都带有 相同的电荷，同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合 并聚结，溶胶愈稳定；③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有 一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂膜的排斥 力才有可能，因此溶剂膜的排斥力是使溶胶稳定的原因之一。 2.胶体金的颜色和光吸收性胶体金颗粒大小不同，颜色不同，光吸收性也不同。胶体 金颗粒直径在5~20nm之间，吸收波长为520nm,呈酒红色：在20~40nm之间其吸收波长
金免疫技术除用于免疫组织化学染色外，还应用于金免疫测定中，由于金标记常与膜载体配 合，形成特定的测定模式，典型的如斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验等，方法简 便、快速，是目前应用广泛的检验方法。 金免疫技术主要有金免疫组织化学染色技术和金免疫测定技术，前者包括金（银） 免疫光镜染色技术和金免疫电镜染色技术；后者包括斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析 试验等。 第一节 胶体金与免疫金的制备 一、胶体金特性及其制备 （一）胶体金的结构 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是金盐被还原成金原子后 形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（金原子 Au）及包围在外的双离子层构成， 紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12 －），外层离子层 H +则分散在胶体间溶液中，以维持 胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大 的胶体金颗粒（一般指大于 30nm 以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗 粒形态。 （二）胶体金性状 1.胶体金一般性质 胶体金颗粒大小多在 1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单 一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电 解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态，使分 散的单一金颗粒凝聚成大颗粒而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体 金、加强其稳定性的作用。 影响胶体金溶液稳定性的主要因素有：①胶体金胶粒间的相互吸引力，当胶粒相距很近 时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大；②水化层的带电情况，一种溶胶的各个胶粒都带有 相同的电荷，同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合 并聚结，溶胶愈稳定；③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有 一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂膜的排斥 力才有可能，因此溶剂膜的排斥力是使溶胶稳定的原因之一。 2.胶体金的颜色和光吸收性 胶体金颗粒大小不同，颜色不同，光吸收性也不同。胶体 金颗粒直径在 5～20nm 之间，吸收波长为 520nm，呈酒红色；在 20～40nm 之间其吸收波长
为530nm,呈深红色：在60nm时其吸收波长为600nm,呈紫色。根据这一特点，用肉眼观察 胶体金的颜色或测定吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小（如表22-1所示）。 (三)胶体金的制备 1.制备原理向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金 颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、 鞣酸等。 2.操作要点最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。①配制氯金酸(HAuC14)溶液， 加热至沸腾：②搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠溶液：③继续加热煮沸一定时间，此时 可观察到淡黄色的氯金酸溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定 成红色，全过程约2~3mi:④冷却至室温后加蒸馏水恢复至原体积。通过改变柠檬酸三钠 的用量可以制得不同大小的胶体金颗粒（见表22-1） 表22-1四种粒径胶体金的制备及特性 胶体金粒径(nm) 1%柠檬酸三钠加入 胶体金特性 量(ml)* 呈色 入max 16 2.00 橙色 518nm 24.5 1.50 橙红色 522nm 41 1.00 红色 525nm 71.5 0.70 紫色 535nm *还原100ml0.01%HAuC1,所需量 3.胶体金的鉴定胶体金的制备并不难，但要制备高质量的胶体金并非易事。因此对每 次制好的胶体金应加以鉴定，主要鉴定指标有颗粒大小、粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。 胶体金颗粒大小可通过在日光下仔细观察胶体金的颜色，进行粗略估计：也可用分光光度计 扫描，根据其最大吸收波长（入max)来估计胶体金颗粒的粒径：有条件时最好作电镜观察 并进行显微摄影，这样可以比较精确地测定胶体金颗粒的平均粒径。良好的胶体金应该是 清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示制备的胶体金有较多凝集颗粒。 4.胶体金的保存胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如 0.02%NaN)更有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并 不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。 5.注意事项 (1)氯金酸易潮解，应于干燥处避光保存
为 530nm，呈深红色；在 60nm 时其吸收波长为 600nm，呈紫色。根据这一特点，用肉眼观察 胶体金的颜色或测定吸收峰波长大小可粗略估计金颗粒的大小（如表 22-1 所示）。 （三）胶体金的制备 1.制备原理 向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子，形成金 颗粒悬液。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、 鞣酸等。 2.操作要点 最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。①配制氯金酸（HAuC14）溶液， 加热至沸腾；②搅动下准确加入一定量的柠檬酸三钠溶液；③继续加热煮沸一定时间，此时 可观察到淡黄色的氯金酸溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定 成红色，全过程约 2～3min；④冷却至室温后加蒸馏水恢复至原体积。通过改变柠檬酸三钠 的用量可以制得不同大小的胶体金颗粒（见表 22-1） 表 22-1 四种粒径胶体金的制备及特性 *还原 100ml0.01％HAuC14 所需量 3.胶体金的鉴定 胶体金的制备并不难，但要制备高质量的胶体金并非易事。因此对每 次制好的胶体金应加以鉴定，主要鉴定指标有颗粒大小、粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。 胶体金颗粒大小可通过在日光下仔细观察胶体金的颜色，进行粗略估计；也可用分光光度计 扫描，根据其最大吸收波长（λmax）来估计胶体金颗粒的粒径；有条件时最好作电镜观察 并进行显微摄影，这样可以比较精确地测定胶体金颗粒的平均粒径。 良好的胶体金应该是 清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示制备的胶体金有较多凝集颗粒。 4.胶体金的保存 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如 0.02％NaN3）更有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并 不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。 5.注意事项 （1）氯金酸易潮解，应于干燥处避光保存。 胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入 量（ml）* 胶体金特性 呈色 λmax 16 2.00 橙色 518nm 24.5 1.50 橙红色 522nm 41 1.00 红色 525nm 71.5 0.70 紫色 535nm
(2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸溶液时，不应使用金属药匙称 量氯金酸。 (3)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 (4)用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。 最好是经硅化处理，硅化方法为用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，蒸馏水冲净，干 燥后备用。 二、免疫金的制备 免疫金(immunogold)是指胶体金与抗原（抗体）的结合物，在免疫组织化学染色技术 中，习惯上称之为金探针。 (一)制备原理 胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质表面带正电荷的基团间靠静电力相互吸引，达到范 德华引力作用范围内即形成牢固的结合，同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条 件。因此，环境H和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质 的分子量及蛋白质浓度等也会影响胶体金与蛋白质的吸附。 (二)技术要点 1.胶体金溶液的pH值调整用KzCO或HC1溶液调节胶体金溶液的pH至选定值。原则 上选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱，但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确 定。 在调节胶体金的H值时应注意，胶体金会阻塞p计的电极，不可直接将电极插入胶体 金溶液中，宜先用终浓度为0.1%的聚乙二醇(PEG20000)稳定胶体金后，再测定胶体金的 pH值。 2.蛋白质最适标记量的确定将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定 量胶体金的试管中，然后分别加入NC1溶液，混匀后静置数小时，对照管（未加蛋白）及加 入蛋白量不足的管，溶液颜色由红变蓝，蛋白量足够或过量的管保持红色不变。以其中能保 持红色不变而蛋白含量最低的一管作为稳定胶体金所必须的最适标记量，在此基础上蛋白含 量增加10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量。 由于蛋白质溶液含盐量较高或形成聚合物极易影响标记过程，因此，标记之前最好将蛋 白质溶液用含低浓度盐的缓冲液透析数小时并高速离心除去聚合物。 3.标记过程在电磁搅拌下将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中， 反应一定时间后加入BSA并调整pH至最适处，放置室温继续反应数分钟
（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸溶液时，不应使用金属药匙称 量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）用以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。 最好是经硅化处理，硅化方法为用 5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，蒸馏水冲净，干 燥后备用。 二、免疫金的制备 免疫金（immunogold）是指胶体金与抗原（抗体）的结合物,在免疫组织化学染色技术 中，习惯上称之为金探针。 （一）制备原理 胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质表面带正电荷的基团间靠静电力相互吸引，达到范 德华引力作用范围内即形成牢固的结合,同时胶体金颗粒的粗糙表面也是形成吸附的重要条 件。因此，环境 pH 和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质 的分子量及蛋白质浓度等也会影响胶体金与蛋白质的吸附。 （二）技术要点 1.胶体金溶液的 pH 值调整 用 K2CO3 或 HC1 溶液调节胶体金溶液的 pH 至选定值。原则 上选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱，但通常最适反应 pH 往往需经多次试验才能确 定。 在调节胶体金的 pH 值时应注意，胶体金会阻塞 pH 计的电极，不可直接将电极插入胶体 金溶液中，宜先用终浓度为 0.1％的聚乙二醇（PEG20000）稳定胶体金后，再测定胶体金的 pH 值。 2.蛋白质最适标记量的确定 将待标记蛋白作一系列稀释后各取一定量加入装有一定 量胶体金的试管中，然后分别加入 NaCl 溶液，混匀后静置数小时，对照管(未加蛋白)及加 入蛋白量不足的管，溶液颜色由红变蓝，蛋白量足够或过量的管保持红色不变。以其中能保 持红色不变而蛋白含量最低的一管作为稳定胶体金所必须的最适标记量，在此基础上蛋白含 量增加 10%-20%即为标记全部胶体金溶液所需的蛋白总量。 由于蛋白质溶液含盐量较高或形成聚合物极易影响标记过程，因此，标记之前最好将蛋 白质溶液用含低浓度盐的缓冲液透析数小时并高速离心除去聚合物。 3.标记过程 在电磁搅拌下将 1/10 体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中， 反应一定时间后加入 BSA 并调整 pH 至最适处，放置室温继续反应数分钟
4.离心纯化离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离 心1h:8nm金颗粒用25000r/min离心45min:14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm 金颗粒用15000r/min离心30min。离心后轻轻吸弃上清液，沉淀用含PEG或BSA的缓冲液 悬浮，恢复至原体积后再离心。如此洗涤2~4次，以彻底除去未结合的蛋白质。 三、免疫金的保存 免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是含稳定剂的缓冲液。缓 冲溶液常用中性的PBS或Tis缓冲液。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的 高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：①保持胶体金的稳定性， 使之便于长期保存：②防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是 十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。 第二节金免疫测定技术 一、斑点金免疫渗滤试验 (一)原理 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)是在以硝酸纤维素膜 为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴 置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到 快速检测目的（一般在5分钟左右完成）。阳性反应在膜上呈现红色斑点。本法简化了操作 步骤，达到简便的目的，已成为“床边检验(point of care test,.POCT)”的主要方法之一。 (二)方法类型 1.双抗体夹心法将抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检标本，若标本中有待测 抗原则在渗滤过程中与膜上抗体结合，然后滴加胶体金标记抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者 即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 2.间接法将抗原包被在硝酸纤维素膜上，依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗 人IgG抗体，再加洗涤液洗涤，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于人 血清标本中非目的IgG的干扰，易产生假阳性结果，临床上较少用。 (三)操作要点 1.试剂盒组成①渗滤装置，是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成成分之一（图 22-1),由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成：②胶体 金标记物：③洗涤液
4.离心纯化 离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对 5nm 金颗粒可选用 40000r/min 离 心 1h；8nm 金颗粒用 25000r/min 离心 45min；14nm 金颗粒用 25000r/min 离心 30min，40nm 金颗粒用 15000r/min 离心 30min。离心后轻轻吸弃上清液，沉淀用含 PEG 或 BSA 的缓冲液 悬浮，恢复至原体积后再离心。如此洗涤 2～4 次，以彻底除去未结合的蛋白质。 三、免疫金的保存 免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是含稳定剂的缓冲液。缓 冲溶液常用中性的 PBS 或 Tris 缓冲液。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的 高分子稳定剂，PEG 和 BSA 是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：①保持胶体金的稳定性， 使之便于长期保存；②防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是 十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。 第二节 金免疫测定技术 一、斑点金免疫渗滤试验 (一) 原理 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)是在以硝酸纤维素膜 为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴 置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到 快速检测目的（一般在 5 分钟左右完成）。阳性反应在膜上呈现红色斑点。本法简化了操作 步骤，达到简便的目的,已成为“床边检验(point of care test,POCT)”的主要方法之一。 (二) 方法类型 1．双抗体夹心法 将抗体包被在硝酸纤维素膜中央，滴加待检标本，若标本中有待测 抗原则在渗滤过程中与膜上抗体结合，然后滴加胶体金标记抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者 即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 2．间接法 将抗原包被在硝酸纤维素膜上，依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗 人 IgG 抗体，再加洗涤液洗涤，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于人 血清标本中非目的 IgG 的干扰,易产生假阳性结果,临床上较少用。 (三) 操作要点 1.试剂盒组成 ①渗滤装置，是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成成分之一(图 22-1)，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成；②胶体 金标记物 ；③洗涤液
图22-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图 2.操作要点①将渗滤装置（或称反应板）平放于实验台面上，于小孔内滴加待测标本 12滴，待完全渗入：②于小孔内滴加免疫金试剂12滴，待完全渗入：③于小孔内滴加洗 涤液23滴，待完全渗入：④在膜中央显示清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之 则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性程度。 二、斑点金免疫层析试验 (一)原理 斑点金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay,DICA)是将胶体金标 记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术，与 斑点金免疫渗滤试验的过滤性能不同，DICA中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管 作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗 体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判 读实验结果。本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。 (二)方法类型 1.双抗体夹心法如图22-2所示，G处为金标特异性抗体（兔型），T处包被了特异性 抗体（兔型），C处包被羊抗兔免疫球蛋白抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本， 通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G处时将金标特异性抗体复溶，若待测标本中含 待测抗原，即形成金标特异性抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标特异性抗体-待测抗 原-特异性抗体复合物，金标特异性抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应， 多余的金标记特异性抗体移至C区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。 图22-2免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原原理示意图 2.竞争法如图22-3所示，G处为金标特异性抗体（兔型），T处包被了标准抗原，C处 包被了羊抗兔免疫球蛋白抗体。测试时待测标本加于A端，若标本中含有待测抗原，流经G 处时结合金标特异性抗体，当混合物移至T处时，因无足够游离的金标特异性抗体与膜上标 准抗原结合，T处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标特异性抗体或金标特异性 抗体复合物流经C处，与该处的羊抗兔免疫球蛋白抗体结合出现棕红色的质控带：若标本中 不含待测抗原，金标特异性抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色线条，实 验结果为阴性，而质控带仍然出现棕红色线条
图 22-1 DIGFA 渗滤装置及操作示意图 2.操作要点 ①将渗滤装置（或称反应板）平放于实验台面上，于小孔内滴加待测标本 1~2 滴，待完全渗入；②于小孔内滴加免疫金试剂 1~2 滴，待完全渗入；③于小孔内滴加洗 涤液 2~3 滴，待完全渗入；④在膜中央显示清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之 则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性程度。 二、 斑点金免疫层析试验 (一) 原理 斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay,DICA）是将胶体金标 记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术，与 斑点金免疫渗滤试验的过滤性能不同，DICA 中滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管 作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗 体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判 读实验结果。本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。 (二) 方法类型 1.双抗体夹心法 如图 22-2 所示，G 处为金标特异性抗体(兔型)，T 处包被了特异性 抗体（兔型），C 处包被羊抗兔免疫球蛋白抗体，B 处为吸水纸。测试时 A 端滴加待测标本， 通过层析作用，待测标本向 B 端移动，流经 G 处时将金标特异性抗体复溶，若待测标本中含 待测抗原，即形成金标特异性抗体-抗原复合物，移至 T 区时，形成金标特异性抗体-待测抗 原-特异性抗体复合物，金标特异性抗体被固定下来，在 T 区显示红色线条，呈阳性反应， 多余的金标记特异性抗体移至 C 区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。 图 22-2 免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原原理示意图 2.竞争法 如图 22-3 所示, G 处为金标特异性抗体（兔型），T 处包被了标准抗原，C 处 包被了羊抗兔免疫球蛋白抗体。测试时待测标本加于 A 端，若标本中含有待测抗原，流经 G 处时结合金标特异性抗体，当混合物移至 T 处时，因无足够游离的金标特异性抗体与膜上标 准抗原结合，T 处无棕红色线条出现，实验结果为阳性，游离金标特异性抗体或金标特异性 抗体复合物流经 C 处，与该处的羊抗兔免疫球蛋白抗体结合出现棕红色的质控带；若标本中 不含待测抗原，金标特异性抗体则与 T 处膜上的标准抗原结合，在 T 处出现棕红色线条，实 验结果为阴性，而质控带仍然出现棕红色线条
图22-3免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图 3.间接法待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记兔抗人免 疫球蛋白抗体会降低试验敏感性，为了消除其影响，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成 反流免疫层析法（图22-4）。 图22一4免疫层析试验间接法检测抗体原理示意图 测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有C膜条，膜上T处包被有己知抗 原，C处包被了羊抗兔免疫球蛋白抗体，E处为含能与蛋白结合的有色染料的标本加样区， F处为吸水材料：左面中央开有观察窗口B,G0处固定有金标记兔抗人免疫球蛋白抗体，A、 D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至G0处使金标记兔抗人免疫球蛋白抗体 复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测 抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时， 在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性 抗体及无关物向E处反向层析，随后而来的金标兔抗人免疫球蛋白抗体与抗原抗体复合物结 合，出现棕红色线条，过量金标兔抗人免疫球蛋白抗体层析至C处，与羊抗兔免疫球蛋白抗 体结合，出现棕红色质控线条。若标本中不含待测特异性抗体，金标兔抗人免疫球蛋白抗体 则不能固定在膜上T处己知抗原上，使在T处不出现棕红色线条，实验结果为阴性，而质控 带仍然出现棕红色线条。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。 (三)技术要点 1.试剂盒组成主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一 试剂条上（如图22-2）。 2.操作要点以双抗体夹心法为例，①将试剂条标记线一端浸入待测标本中25秒或在 标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上：②520分钟内观察结果；③结果判断： 出现一条棕红线质控条带为阴性，出现两条棕红线条带为阳性，无棕红线质控条带出现则试 剂失效。 三.临床应用及评价 (一)金免疫测定技术特点
图 22-3 免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图 3．间接法待测血清标本中大量的非特异性 IgG 与特异性 IgG 竞争结合金标记兔抗人免 疫球蛋白抗体会降低试验敏感性，为了消除其影响，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成 反流免疫层析法(图 22-4)。 图 22－4 免疫层析试验间接法检测抗体原理示意图 测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有 NC 膜条，膜上Ｔ处包被有已知抗 原，Ｃ处包被了羊抗兔免疫球蛋白抗体，E 处为含能与蛋白结合的有色染料的标本加样区， F 处为吸水材料；左面中央开有观察窗口 B，Go 处固定有金标记兔抗人免疫球蛋白抗体，A、 D 处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在 D 处层析至 Go 处使金标记兔抗人免疫球蛋白抗体 复溶，然后将标本加在 E 处使其与染料一起在膜的层析作用下向 F 端移动，若标本中有待测 抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线 G 处时， 在 F 处加缓冲液，合上测试卡，A 处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性 抗体及无关物向 E 处反向层析，随后而来的金标兔抗人免疫球蛋白抗体与抗原抗体复合物结 合，出现棕红色线条，过量金标兔抗人免疫球蛋白抗体层析至Ｃ处，与羊抗兔免疫球蛋白抗 体结合，出现棕红色质控线条。若标本中不含待测特异性抗体，金标兔抗人免疫球蛋白抗体 则不能固定在膜上 T 处已知抗原上，使在 T 处不出现棕红色线条，实验结果为阴性，而质控 带仍然出现棕红色线条。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。 （三）技术要点 1.试剂盒组成 主要成分为胶体金层析条，所用试剂全部为干试剂，它们被组合在一 试剂条上(如图 22-2)。 2.操作要点 以双抗体夹心法为例，①将试剂条标记线一端浸入待测标本中 2~5 秒或在 标本加样处加一定量待检标本，平放于水平桌面上；②5~20 分钟内观察结果；③结果判断： 出现一条棕红线质控条带为阴性，出现两条棕红线条带为阳性，无棕红线质控条带出现则试 剂失效。 三. 临床应用及评价 （一）金免疫测定技术特点
本法具有操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、 便于保存等特点，因此特别符合“床边检验”项目的要求。 (二)金免疫测定技术灵敏度问题 金免疫测定技术灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临床应用中应引起高度重 视。 (三)金免疫测定技术临床应用 由于金免疫测定技术不能准确定量，故临床上只能作为定性或半定量试验，目前主要应 用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而 在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）的检测。 第三节金免疫组织化学染色技术 一、免疫金（银）光镜染色技术 (一)原理 免疫金银染色(immunogold silver staining,IGSS)是在金免疫技术基础上发展起来 的更为敏感的技术。1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法。 基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还 原剂将银离子(Ag)还原成银原子(Ag),被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”， “银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“， 最终使抗原位置得到清楚放大（图22-5）。 图22-5免疫金银染色原理示意图 金标记抗抗体 特异性抗体 新鲜银染液 抗原基质片 图22-5免疫金银染色原理示意图 (二)技术要点 1.配制银染色液在3.5柠檬酸缓冲液中加入明胶、对苯二酚、硝酸银配制而成
本法具有操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备，试剂稳定、 便于保存等特点，因此特别符合“床边检验”项目的要求。 （二）金免疫测定技术灵敏度问题 金免疫测定技术灵敏度不及酶标法和酶发光免疫测定法，在临床应用中应引起高度重 视。 （三）金免疫测定技术临床应用 由于金免疫测定技术不能准确定量，故临床上只能作为定性或半定量试验，目前主要应 用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而 在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG 等）的检测。 第三节 金免疫组织化学染色技术 一、免疫金（银）光镜染色技术 (一)原理 免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）是在金免疫技术基础上发展起来 的更为敏感的技术。1983 年，Holgate 等人将 IGS 与银显影方法相结合创立了免疫金银法。 基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还 原剂将银离子(Ag+ )还原成银原子(Ag)，被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”， “银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“， 最终使抗原位置得到清楚放大（图 22-5）。 图 22-5 免疫金银染色原理示意图 （二） 技术要点 1. 配制银染色液 在 pH3.5 柠檬酸缓冲液中加入明胶、对苯二酚、硝酸银配制而成
2.染色①被检血清经适当稀释后均匀滴加在细胞抗原片上，被检血清中抗体与片上 抗原结合，流水冲洗后再用缓冲液冲洗，加BSA进行封闭：②滴加适当稀释的SPA-胶体金 进行反应：③滴加新鲜配制的银染液，室温避光进行染色反应：④流水冲洗，晾干，中性树 胶封片后光镜下检查，见银灰色颗粒沉积者为阳性。 (三)注意事项 1.此法具有分辨率高、定位精确的优点。 2.所用玻璃器皿应洁净，所用蒸馏水必须双蒸或三蒸。 3.配制胶体金溶液时，调整各试剂的比例可获直径不同的金颗粒。直径>I0m的金粒 子不易穿透组织，故作细胞内抗原定位时，以配制直径5m的金溶胶为宜。 4.硝酸银、对苯二酚溶液应避光保存并临用时现配。 5.被检血清中有其他自身抗体，如抗平滑肌抗体、抗心肌抗体、抗线粒体抗体等时， 其抗原片应根据专门试验的要求制备。 二、免疫金电镜染色技术 (一)原理 胶体金标记物与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合反应，由于胶体金颗粒具有高电 子密度的特性，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而对细胞膜上或细胞内的蛋 白质进行定性与定位。 (二)技术要点 1.标本包理用戊二醛对标本进行固定，后行饿酸固定（固定膜结构），丙酮或乙醇逐级 脱水，包埋(Epon812树脂)，超薄切片(80nm)置300目镍网上。 2.免疫组化染色白蛋白封闭，加第一抗体，孵育，PS冲洗，卵白蛋白封闭，加第二 抗体（胶体金标记IgG),孵育，PBS冲洗，蒸馏水冲洗，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复染，电镜 观察。 (三)注意事项 1.以上染色步骤除清洗外，皆在滴于蜡膜（封口膜）上的各种液体小滴上进行。应注 意始终保持镍网湿润，不得让任何一种液体干于网上，并要吸去镊子尖部夹起的多余液体。 2.用于电镜观察的免疫金法可分为包埋前染色和包埋后染色两大类，包埋后染色具有 简便可靠，结果重复性好，能在同一组织切片上进行多重免疫染色的优点，但会使某些抗原 失活，不易保持细胞膜结构完整。 三、临床应用与评价
2．染色 ①被检血清经适当稀释后均匀滴加在细胞抗原片上，被检血清中抗体与片上 抗原结合，流水冲洗后再用缓冲液冲洗，加 BSA 进行封闭；②滴加适当稀释的 SPA-胶体金 进行反应；③滴加新鲜配制的银染液，室温避光进行染色反应；④流水冲洗，晾干，中性树 胶封片后光镜下检查，见银灰色颗粒沉积者为阳性。 （三）注意事项 1．此法具有分辨率高、定位精确的优点。 2．所用玻璃器皿应洁净，所用蒸馏水必须双蒸或三蒸。 3．配制胶体金溶液时，调整各试剂的比例可获直径不同的金颗粒。直径>lOnm 的金粒 子不易穿透组织，故作细胞内抗原定位时，以配制直径 5nm 的金溶胶为宜。 4．硝酸银、对苯二酚溶液应避光保存并临用时现配。 5．被检血清中有其他自身抗体，如抗平滑肌抗体、抗心肌抗体、抗线粒体抗体等时， 其抗原片应根据专门试验的要求制备。 二、免疫金电镜染色技术 （一） 原理 胶体金标记物与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合反应,由于胶体金颗粒具有高电 子密度的特性，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而对细胞膜上或细胞内的蛋 白质进行定性与定位。 （二） 技术要点 1．标本包理 用戊二醛对标本进行固定，后行锇酸固定(固定膜结构)，丙酮或乙醇逐级 脱水，包埋(Epon812 树脂)，超薄切片(80nm)置 300 目镍网上。 2．免疫组化染色 白蛋白封闭，加第一抗体，孵育，PBS 冲洗，卵白蛋白封闭，加第二 抗体(胶体金标记 IgG )，孵育，PBS 冲洗，蒸馏水冲洗，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复染，电镜 观察。 （三）注意事项 1．以上染色步骤除清洗外，皆在滴于蜡膜（封口膜）上的各种液体小滴上进行。应注 意始终保持镍网湿润，不得让任何一种液体干于网上，并要吸去镊子尖部夹起的多余液体。 2．用于电镜观察的免疫金法可分为包埋前染色和包埋后染色两大类，包埋后染色具有 简便可靠，结果重复性好，能在同一组织切片上进行多重免疫染色的优点，但会使某些抗原 失活，不易保持细胞膜结构完整。 三、临床应用与评价
(一)金免疫组织化学染色技术在电镜水平的应用 主要应用于：①细胞悬液或单层培养细胞细胞表面抗原的观察：②单层培养细胞细胞内 抗原的检测：③组织抗原的检测。 该法样本用量少，检测速度快，对比明显，操作简单，敏感性高和特异性好，既可用于 抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。 (二)金免疫组织化学染色技术在光镜水平的应用 主要应用于：①用单克隆抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原： ②检测培养的单层细胞胞内抗原：③组织中或亚薄切片中抗原的检测。 胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干 扰等缺点。 (陶志华)
（一）金免疫组织化学染色技术在电镜水平的应用 主要应用于：①细胞悬液或单层培养细胞细胞表面抗原的观察；②单层培养细胞细胞内 抗原的检测；③组织抗原的检测。 该法样本用量少，检测速度快，对比明显，操作简单，敏感性高和特异性好，既可用于 抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。 （二）金免疫组织化学染色技术在光镜水平的应用 主要应用于：①用单克隆抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原； ②检测培养的单层细胞胞内抗原；③组织中或亚薄切片中抗原的检测。 胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干 扰等缺点。 (陶志华)