▪ 一、人工染色体构建 ▪ 二、新的测序策略-全基因组鸟枪法测序 ▪ 三、全基因组序列分析-基因组学的新内容 ▪ 四、比较基因组学(Comparative genomics)
▪ 一、人工染色体构建 ▪ 二、新的测序策略-全基因组鸟枪法测序 ▪ 三、全基因组序列分析-基因组学的新内容 ▪ 四、比较基因组学(Comparative genomics)
一、人工染色体构建 1983年,美国的Dana-Farber癌症研究所和 哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章, 报道了构建YAC(Yeast Artificial Chromosome) 库的过程。1987年,Burke等人发现,仅仅带有 ARS序列的载体虽然能够被复制,但极易在有丝 分裂时丢失。即使在选择培养基上,也只有5%- 20%的子代细胞带有ARS载体。加入 Centromeres (CEN)能显著提高ARS质粒在有 丝分裂时的稳定性,90%以上子代细胞带有该载 体。CEN还能显著降低拷贝数,从20-50/细胞降 为1-2/细胞。(Science, 236:806-812)
一、人工染色体构建 1983年,美国的Dana-Farber癌症研究所和 哈佛大学医学院的教授首次在Nature上发表文章, 报道了构建YAC(Yeast Artificial Chromosome) 库的过程。1987年,Burke等人发现,仅仅带有 ARS序列的载体虽然能够被复制,但极易在有丝 分裂时丢失。即使在选择培养基上,也只有5%- 20%的子代细胞带有ARS载体。加入 Centromeres (CEN)能显著提高ARS质粒在有 丝分裂时的稳定性,90%以上子代细胞带有该载 体。CEN还能显著降低拷贝数,从20-50/细胞降 为1-2/细胞。(Science, 236:806-812)
人工染色体含有三种必需成分:着丝粒、端粒和复 制起点。 ▪ 着丝粒(CEN)位于染色体中央,呈纽扣状结构, 在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动,也 是姐妹染色单体配对时的最后位点,接收细胞信 号而使姐妹染色体分开。 ▪ 端粒(TEL):主要功能是防止染色体融合、降 解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模 板,在染色体端部添加上端粒重复序列,并参与 端粒长度和细胞增殖的调控。 ▪ 复制起点: DNA复制通常由起始蛋白与特定的 DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和 DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同 一段长约100bp的DNA上
人工染色体含有三种必需成分:着丝粒、端粒和复 制起点。 ▪ 着丝粒(CEN)位于染色体中央,呈纽扣状结构, 在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动,也 是姐妹染色单体配对时的最后位点,接收细胞信 号而使姐妹染色体分开。 ▪ 端粒(TEL):主要功能是防止染色体融合、降 解、确保其完整复制。端粒酶以其自身RNA为模 板,在染色体端部添加上端粒重复序列,并参与 端粒长度和细胞增殖的调控。 ▪ 复制起点: DNA复制通常由起始蛋白与特定的 DNA序列相互作用开始。DNA合成的起始位点和 DNA复制起点(遗传位点)所需的Cis靶区常位于同 一段长约100bp的DNA上
(A)PYAC3 CEN4 SnaBl KEY CEN4 Centromere from yeast chromosome 4 SUP4 ori Origin of replication TRPI SUP4 Selectable markers TRP URA3 URA3 1川4kb TEL TEL RomHl BamHl
(B)Cloning with pYAC3 SnaBl Restrict with BamHI +SnaBl 盖■ Left arm Right arm BamHI BamHI Ligate with blunt-ended insert DNA TRPI CEN TEL ori URA3 TEL Insert DNA Figure 4.12 Working with a YAC
▪ YAC的主要缺点 1.存在高比例的嵌合体,即一个YAC克隆 含有两个本来不相连的独立片段; 2.部分克隆子不稳定,在转代培养中可能 会发生缺失或重排; 3.难与酵母染色体区分开,因为YAC与酵 母染色体具有相似的结构。 4.操作时容易发生染色体机械切割
▪ YAC的主要缺点 1.存在高比例的嵌合体,即一个YAC克隆 含有两个本来不相连的独立片段; 2.部分克隆子不稳定,在转代培养中可能 会发生缺失或重排; 3.难与酵母染色体区分开,因为YAC与酵 母染色体具有相似的结构。 4.操作时容易发生染色体机械切割
▪ 以细 菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低, 转化效率高,又易于分离。科学家用"染色体建造"法用F质 粒及其调控基因构建细菌载体,克隆大片段DNA。该质粒 主要包括oriS, repE(控制F质粒复制)和parA、 parB (控制拷贝数)等成分
▪ 以细 菌寄主系统为基础的克隆载体形成嵌合体的频率较低, 转化效率高,又易于分离。科学家用"染色体建造"法用F质 粒及其调控基因构建细菌载体,克隆大片段DNA。该质粒 主要包括oriS, repE(控制F质粒复制)和parA、 parB (控制拷贝数)等成分
BAC的优点 1. 易于用电击法转化E.coli(转化效率比转化酵 母高10-100倍); 2. 超螺旋环状载体,易于操作; 3. F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制; 4. 很少发生体内重排。 有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA 单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因 组DNA混合,产生了能被复制、能正常分裂并得 到长期稳定保存的人工合成的染色体,长度约为 6-10Mb,称为MAC或HAC
BAC的优点 1. 易于用电击法转化E.coli(转化效率比转化酵 母高10-100倍); 2. 超螺旋环状载体,易于操作; 3. F'质粒本身所带的基因控制了质粒的复制; 4. 很少发生体内重排。 有人把人类染色体端粒DNA上单个α-卫星DNA 单元多聚化形成1Mb左右的大片段并与人类基因 组DNA混合,产生了能被复制、能正常分裂并得 到长期稳定保存的人工合成的染色体,长度约为 6-10Mb,称为MAC或HAC