实验九：食品中维生素C的含量测定
实验九： 食品中维生素C的含量测定
一、 目的要求 理解2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总 量的基本原理。学习其操作方法和了解影响 测定准确性的因素。 二、实验原理 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐 糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化 为脱氢抗坏血酸，再与2,4-二硝基苯肼作用 生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量 呈正比，可进行比色定量
◼ 一、目的要求 ◼ 理解2,4–二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总 量的基本原理。学习其操作方法和了解影响 测定准确性的因素。 ◼ 二、实验原理 ◼ 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐 糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化 为脱氢抗坏血酸，再与2,4–二硝基苯肼作用 生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量 呈正比，可进行比色定量
三、仪器与试剂 ◆ (一)试剂 ◆ 1、,4.5moL硫酸：量取250mL浓硫酸小心加入700mL水中，冷却后用水稀释至 1000mL. 2、85%硫酸：小心加900mL浓疏酸于100mL水中。 示脊行泳精费米攀沃覆辑态须體米册29于100mL4,5moL破酸中，过滤， ■4、2%草酸溶液。 ■5、1%草酸溶液。 ■6、1%硫脲溶液：溶解1g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 ■7、2%硫脲溶液：溶解2g硫脲于100L1%草酸溶液中 。8、1mo/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。 9、抗坏血酸标准溶液：.称取100g纯抗坏血酸溶解于100mL2%草酸溶液中，此 溶液每毫升相当于1g抗坏血酸。 ◆ 10、活性炭：将100g活性炭加到750mL1moL盐酸中，回流1hr2h,过滤，用水 洗数次，至滤液中无铁离子(F3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干
三、仪器与试剂 ◼ （一）试剂 ◼ 1、4.5mol/L硫酸：量取250mL浓硫酸小心加入700mL水中，冷却后用水稀释至 1000mL。 ◼ 2、85%硫酸：小心加900mL浓硫酸于100mL水中。 ◼ 3、2% 2,4–二硝基苯肼：溶解2,4–二硝基苯肼2g于100mL 4.5mol/L硫酸中，过滤。 不用时存于冰箱内，每次使用前必须过滤。 ◼ 4、2%草酸溶液。 ◼ 5、1%草酸溶液。 ◼ 6、1%硫脲溶液：溶解1g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 ◼ 7、2%硫脲溶液：溶解2g硫脲于100mL1%草酸溶液中。 ◼ 8、1mol/L盐酸：取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。 ◼ 9、抗坏血酸标准溶液：称取100mg纯抗坏血酸溶解于100mL 2%草酸溶液中，此 溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸。 ◼ 10、活性炭：将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中，回流1h~2h，过滤，用水 洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干
■（二）仪器 ■1、恒温箱或电热恒温水浴锅。 ■2、可见光分光光度计。 ■3、捣碎机
◼ （二）仪器 ◼ 1、恒温箱或电热恒温水浴锅。 ◼ 2、可见光分光光度计。 ◼ 3、捣碎机
四、实验步骤 1、样品处理（全部实验过程应避光） (1)鲜样的制备：称取100g鲜样即加入100L2%草酸溶液， 倒入捣碎机中打成匀浆，称取10.0g~40.0g匀浆（含1mg2mg抗 坏血酸)倒入100mL容量瓶，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 过滤，滤液备用。 ◆ (2)干样制备：称取1g~4g干样（含1mg2mg抗坏血酸）放 入乳钵内，加入等量的1%草酸溶液磨成匀浆，连固形物一起倒 入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。过滤备 用。 2、样品还原型抗坏血酸的氧化处理 量取25.0mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min,过滤，弃去 最初数毫升滤液。吸取10.0mL此氧化提取液，加入10.0mL2% 硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液
四、实验步骤 1、样品处理（全部实验过程应避光）。 ◼ （1）鲜样的制备：称取100g鲜样即加入100mL 2%草酸溶液， 倒入捣碎机中打成匀浆，称取10.0g~40.0g匀浆（含1mg~2mg抗 坏血酸）倒入100mL容量瓶，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。 过滤，滤液备用。 ◼ （2）干样制备：称取1g ~ 4g干样（含1mg~2mg抗坏血酸）放 入乳钵内，加入等量的1%草酸溶液磨成匀浆，连固形物一起倒 入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。过滤备 用。 2、样品还原型抗坏血酸的氧化处理 ◼ 量取25.0mL上述滤液，加入2g活性炭，振摇1min，过滤，弃去 最初数毫升滤液。吸取10.0mL此氧化提取液，加入10.0mL 2% 硫脲溶液，混匀，此试样为稀释液
3、呈色反应 (1)取3支试管，各加入4L经氧化处理的样品稀释 液。基中一支试管作为空白，向其余两试管加入 1.0mL2%2,4-二硝基苯肼溶液，将所有试管放入 37℃士0.5℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h。 (2)3后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水 中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入2%2,4-二 硝基苯肼溶液1.0mL,在室温中放置10min~15min, 后放入冰水内。其余步骤同试样。 4、85%疏酸处理 ■当试管放入冰水冷却后，向每一试管（连同空白管） 中加入85%硫酸5mL,滴加时间至少需要1min,需边 加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置 30min后比色
3、呈色反应 ◼ （1）取3支试管，各加入4mL经氧化处理的样品稀释 液。基中一支试管作为空白，向其余两试管加入 1.0mL 2%2,4–二硝基苯肼溶液，将所有试管放入 37℃±0.5℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h。 ◼ （2）3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水 中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入2%2,4–二 硝基苯肼溶液1.0mL，在室温中放置10min~15min， 后放入冰水内。其余步骤同试样。 4、85%硫酸处理 ◼ 当试管放入冰水冷却后，向每一试管（连同空白管） 中加入85%硫酸5mL，滴加时间至少需要1min，需边 加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置 30min后比色
5、样品比色测定 用1cm比色皿， 以空白液调零点，于500nm波长测定吸光值。 6、标准曲线绘制 (1)加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min后过滤。吸取 10.00mL滤液放入500mL容量瓶中加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀 释至刻度。抗坏血酸浓度20μg/mL。 吸取5,10，.20,25,40,50,60mL稀释液，分别放放7个 100L容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗 坏血酸的深度分别为1,2,4,5,8,10,12中g/ml,为抗坏血酸 标准使用液。 ◆ (2)分别吸取4L各不同深度的抗坏血酸标准使用液，于7个试管 中，吸取4mL水于试剂空白管，各加入1.0mL2%2,4-二硝基苯册 溶液，混匀，将全部试管放入37℃士5℃恒温箱或恒温水浴中，保 温3h。 3后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入 5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min,边加边摇，。.将试管自 冰水取出，在室温放置30mn后，以试剂空百管调零，并比色测定。 以吸光值为纵坐标，抗坏血酸含量(g)为横坐标绘制标准曲线 或计算回归方程
5、样品比色测定 ◼ 用1cm比色皿，以空白液调零点，于500nm波长测定吸光值。 6、标准曲线绘制 ◼ （1）加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min后过滤。吸取 10.00mL滤液放入500mL容量瓶中加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀 释至刻度。抗坏血酸浓度20μg/mL。 ◼ 吸取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放放7个 100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗 坏血酸的深度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL，为抗坏血酸 标准使用液。 ◼ （2）分别吸取4mL各不同深度的抗坏血酸标准使用液，于7个试管 中，吸取4mL水于试剂空白管，各加入1.0mL 2%2,4–二硝基苯肼 溶液，混匀，将全部试管放入37℃±5℃恒温箱或恒温水浴中，保 温3h。 ◼ 3h后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入 5mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，边加边摇，。将试管自 冰水取出，在室温放置30min后，以试剂空白管调零，并比色测定。 ◼ 以吸光值为纵坐标，抗坏血酸含量（mg）为横坐标绘制标准曲线 或计算回归方程
五、结果计算 X=×100 m 式中X一 样品中总抗坏血酸含量[mg/100g] C 由标准曲线查得或由回归方程算得试样 测定液总抗坏血酸含量(mg); 一测定时所取滤液相当于样品的用量 (g)。 计算结果表示到小数点后两位
五、结果计算 ◼ 式中X——样品中总抗坏血酸含量[mg/100g]； ◼ c——由标准曲线查得或由回归方程算得试样 测定液总抗坏血酸含量（mg）； ◼ m——测定时所取滤液相当于样品的用量 （g）。 ◼ 计算结果表示到小数点后两位。 = 100 m c X
六、考思考题 ■1、试样制备过程为何要避光处理？ ■2、为何加入85%疏酸溶液时，速度要慢而且 需在冰水浴条件下完成？解释若加酸速度过快 使样品管中液体变黑的原因。 ■3、样品比色测定时，用样品空白管调零的目 的何在？
六、考思考题 ◼ 1、试样制备过程为何要避光处理？ ◼ 2、为何加入85%硫酸溶液时，速度要慢而且 需在冰水浴条件下完成？解释若加酸速度过快 使样品管中液体变黑的原因。 ◼ 3、样品比色测定时，用样品空白管调零的目 的何在？