实验十、食品中苏丹红染料的测定 标准依据： GB/T19681-2005食品中苏丹红染料的测定
实验十、食品中苏丹红染料的测定 标准依据: GB/T19681-2005食品中苏丹红染料的测定
、 目的要求 学习食品中苏丹红染料测定的原理和方法。 二、 实验原理 苏丹红色素是应用于油彩蜡、地板蜡和 香皂等化工产品中的一种非生物合成的着色 剂，非食用色素，长期食用具有致癌致畸作 用。苏丹红色素一般不溶于水易溶于有机溶 剂，待测样品经有机溶剂提取，经浓缩及氧 化铝柱层析萃取净化，用反相高效液相色 谱一紫外可见光检测器进行色谱分析，采用 外标法定量
◼ 一、目的要求 ◼ 学习食品中苏丹红染料测定的原理和方法。 ◼ 二、实验原理 苏丹红色素是应用于油彩蜡、地板蜡和 香皂等化工产品中的一种非生物合成的着色 剂，非食用色素，长期食用具有致癌致畸作 用。苏丹红色素一般不溶于水易溶于有机溶 剂，待测样品经有机溶剂提取，经浓缩及氧 化铝柱层析萃取净化，用反相高效液相色 谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用 外标法定量
三、仪器与试剂 (一)试剂 1、乙腈（色谱纯） 2、丙酮（色谱纯、分析纯） ◆ 3、甲酸（分析纯） 4、乙醚（分析纯） ◆ 5、正己烷（分析纯） ◆ 6、无水硫酸钠（分析纯》 7、层析柱管：1cm(内径)5cm(高)的注射器管。 8、层析用氧化铝（中性100目~200目） 9、氧化铝层析柱10、5%丙酮的正己烷溶液：吸取50mL丙酮用 正己烷定容至1L。 11、标准物质：苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红V;纯度 ≥95%。 12、标准贮备液：分别称取苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏 丹红IV各10.0mg(按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容 至250mL
三、仪器与试剂 ◼ （一）试剂 ◼ 1、乙腈（色谱纯） ◼ 2、丙酮（色谱纯、分析纯） ◼ 3、甲酸（分析纯） ◼ 4、乙醚（分析纯） ◼ 5、正己烷（分析纯） ◼ 6、无水硫酸钠（分析纯） ◼ 7、层析柱管：1cm (内径)5cm (高)的注射器管。 ◼ 8、层析用氧化铝（中性 100目~200目） ◼ 9、氧化铝层析柱10、5%丙酮的正己烷溶液：吸取50mL 丙酮用 正己烷定容至1L。 ◼ 11、标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度 ≥95%。 ◼ 12、标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏 丹红Ⅳ各10.0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容 至250mL
(二)仪器 ■1、高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器） 2、分析天平：感量0.1mg 3、旋转蒸发仪 4、均质机或匀浆机 5、粉碎机 6、离心机 7、 0.45μm有机滤膜
（二）仪器 ◼ 1、高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器） ◼ 2、分析天平：感量 0.1mg ◼ 3、旋转蒸发仪 ◼ 4、均质机或匀浆机 ◼ 5、粉碎机 ◼ 6、离心机 ◼ 7、0.45μm有机滤膜
四、实验步骤 样品制备：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需粉 碎磨细。 (二)样品处理： 1、红辣椒粉等粉状样品 ◆ 称取1g~2g(准确至0.0019)样品于三角瓶中，加入 10mL~20mL正己烷，超声处理5min,过滤，用10ml 正疠準涤残湾数次，至洗出液无色，合并正己烷液， 旋转 仪浓缩至5L以下，慢慢加入氧化铝层析柱中 为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时 上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量 多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱：控制氧化铝表面吸附 的色素带宽宜小于0.5c,待样液完全流出后，视样品中 含油类杂质的多少用10mL30mL正己烷洗柱，直至流 出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己 烷液60L洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至 5mL,经0.45m有机滤膜过滤后待测
四、实验步骤 （一）样品制备：将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需粉 碎磨细。 （二）样品处理： ◼ 1、红辣椒粉等粉状样品 ◼ 称取1g ~ 2 g（准确至0.001 g）样品于三角瓶中，加入 10mL ~20mL 正己烷，超声处理5min，过滤，用10 mL 正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用 旋转蒸发仪浓缩至5 mL 以下，慢慢加入氧化铝层析柱中， 为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时 上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量 多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表面吸附 的色素带宽宜小于0.5cm，待样液完全流出后，视样品中 含油类杂质的多少用10mL ~30mL 正己烷洗柱，直至流 出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己 烷液60mL 洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至 5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测
2、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 称取0.5g2g(准确至0.001g)样品于小烧杯中 加入约1mL~10mL正己烷溶解，难溶解的样品可于正 己烷中加温溶解。然后按1中“慢慢加入氧化铝层析 柱.经0.45um有机滤膜过滤后待测”操作。 3、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 称取10g~20g(准确至0.01g)样品于离心管中，加 10mL20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多 加水，加入30mL正己烷：丙酮=3：.1，匀浆5min, 3000rpm离心10min,吸出正己烷层，于下层再加入 20L2次正已烷匀浆，过滤。合并3次正已烷，加入无 水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5 分钟，用5L正已烷溶解残渣后，按1中“慢慢加入 氧化铝层析柱.经0.45m有机滤膜过滤后待测”操 作
◼ 2、红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品 ◼ 称取0.5g~2g（准确至0.001 g）样品于小烧杯中， 加入约1mL ~ 10mL 正己烷溶解,难溶解的样品可于正 己烷中加温溶解。然后按1中“慢慢加入氧化铝层析 柱.经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操作。 ◼ 3、辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品 ◼ 称取10g ~ 20g (准确至0.01g)样品于离心管中，加 10mL ~20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多 加水，加入30mL 正己烷 ：丙酮 =3 ：1，匀浆5min ， 3000 rpm离心10min，吸出正己烷层，于下层再加入 20mL2次正己烷匀浆，过滤。合并3次正己烷，加入无 水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5 分钟，用5mL 正己烷溶解残渣后，按1中“慢慢加入 氧化铝层析柱.经0.45μm有机滤膜过滤后待测”操 作
4、 香肠等肉制品 称取粉碎样品10g~20g(准确至0.01g)于三 角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min,滤 出清夜，再以20mL2次正己烷匀浆，过滤。合 并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤 后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按1中“慢慢 加入氧化铝层析柱.经0.45μm有机滤膜过滤 后待测”操作
◼ 4、香肠等肉制品 ◼ 称取粉碎样品10g ~ 20g (准确至0.01g)于三 角瓶中，加入60mL 正己烷充分匀浆5min，滤 出清夜，再以20mL2次正己烷匀浆，过滤。合 并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤 后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按1中“慢慢 加入氧化铝层析柱.经0.45μm有机滤膜过滤 后待测”操作
(三)测定 色谱检测条件 (1)色谱柱：Zorbax SB-C183.5um4.6mm150mm (或相当型号色谱柱) (2)流动相：溶剂A0.1%甲酸的水溶液：乙腈=85： 15:溶剂B0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20 (3)梯度洗脱 (4)柱温：30C (5)检测波长：苏丹红I478nm;苏丹红Ⅱ、苏丹红 Ⅲ、苏丹红IV520nm;于苏丹红I出峰后切换
（三）测定 ◼ 色谱检测条件 （1）色谱柱：Zorbax SB-C18 3.5μm 4.6mm150mm （或相当型号色谱柱） （2）流动相： 溶剂A 0.1%甲酸的水溶液 ：乙腈 = 85 ： 15； 溶剂B 0.1%甲酸的乙腈溶液 ：丙酮 = 80 ：20 （3）梯度洗脱 (4) 柱温：30℃ （5）检测波长：苏丹红Ⅰ 478nm ；苏丹红Ⅱ、苏丹红 Ⅲ、苏丹红Ⅳ 520nm ；于苏丹红Ⅰ出峰后切换
2、标准曲线制备 吸取标准贮备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、 1.6mL,用正己烷定容至25mL,此标准系列 浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg mL,各进样量10uL,绘制标准曲线。 ■ 3、样品测定：吸取10L样品处理液，按标准 曲线制备检测色谱条件对样品进行测定。与标 样对照，根据峰保留时间定性以及相应峰面积 定量
2、标准曲线制备 ◼ 吸取标准贮备液0、0.1、0.2、0.4、0.8、 1.6mL ，用正己烷定容至25mL ，此标准系列 浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56μg / mL ，各进样量10μL，绘制标准曲线。 ◼ 3、样品测定：吸取10μL样品处理液，按标准 曲线制备检测色谱条件对样品进行测定。与标 样对照，根据峰保留时间定性以及相应峰面积 定量
五、结果计算 ■X=c*V/m 式中X一样品中苏丹红含量(mg/kg)； c一由标准曲线得出的样液中苏丹红 的浓度（μgImL): V 一样液定容体积(mL); m 样品质量(g)
五、结果计算 ◼ X= c*V/m ◼ 式中 X——样品中苏丹红含量（mg / kg）； ◼ c ——由标准曲线得出的样液中苏丹红 的浓度（μg / mL）； ◼ V——样液定容体积（mL）； ◼ m ——样品质量（g）