实验一鼠伤寒沙门氏菌回复 突变实验
实验一 鼠伤寒沙门氏菌回复 突变实验
一、 目的与要求 1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。 ·2、掌握回复突变的测试方法。 ·二、实验原理 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨 酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突 变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型 的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据 此判断受试物是否为致突变物。 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液
◼ 一、目的与要求 ◼ 1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。 ◼ 2、掌握回复突变的测试方法。 ◼ 二、实验原理 ◼ 鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨 酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突 变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型 的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据 此判断受试物是否为致突变物。 ◼ 某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液
三、培养基和试剂 ■1、0.5mmo/L组氨酸-0.5mmo/L生物素溶液 ·2、顶层琼脂培养基 ■3、底层琼脂培养基 ■ 4、营养肉汤培养基 ■5、 盐溶液(1.65mol/LKC+0.4mol/LMgC2) ■6、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) ■7、S9混合液 ■8、溶剂的选择
三、培养基和试剂 ◼ 1、 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液 ◼ 2、顶层琼脂培养基 ◼ 3、底层琼脂培养基 ◼ 4、营养肉汤培养基 ◼ 5、盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2) ◼ 6、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) ◼ 7、S9混合液 ◼ 8、溶剂的选择
四、操作方法 1、增菌培养 取营养肉汤培养基5l,加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培 养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡(100次min)培养10h。该菌 株培养物应每毫升不少于1~2×109活菌数。 ■2、平板掺入法 实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养 基2.0L分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增 菌液0.1mL,受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL(需代谢活化时)，充 分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放 置待冷凝固化后，倒置于37°℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳 性诱变剂对照和无菌对照
四、操作方法 ◼ 1、增菌培养 ◼ 取营养肉汤培养基5ml，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培 养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h。该菌 株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数。 ◼ 2、平板掺入法 ◼ 实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养 基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增 菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充 分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放 置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。 ◼ 实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳 性诱变剂对照和无菌对照
五、数据处理和结果判断 记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂 对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平 均值和标准差。 ■如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两 倍或两倍以上，并呈剂量反应关系者，则该受试物 判定为致突变阳性。 ■受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验 菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报 告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受 试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均 为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性
五、数据处理和结果判断 ◼ 记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂 对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平 均值和标准差。 ◼ 如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两 倍或两倍以上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物 判定为致突变阳性。 ◼ 受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验 菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报 告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受 试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均 为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性
六、试验报告 试验报告应包括以下内容： (1)受试物名称、理化性状、配制方法、使用 溶剂： (2)试验菌株：所用试验菌株： (3)代谢活化系统：所用诱导剂； (4)试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量 分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性 对照，阳性结果判定标准： (5)结果：以列表方式报告受试物的Ames实 验结果（表1）； —6结论
六、试验报告 ◼ 试验报告应包括以下内容： ◼ （1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用 溶剂； ◼ （2）试验菌株：所用试验菌株； ◼ （3）代谢活化系统：所用诱导剂； ◼ （4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量 分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性 对照，阳性结果判定标准； ◼ （5）结果：以列表方式报告受试物的Ames实 验结果（表1）； ◼ （6）结论
表1Ames试验菌株的回变结果（平均值士标准差） 组别 剂量 TA97 TA98 TA100 -(S9)+(S9) (mg/皿) (S9)+(S9) (S9)±(S9) (S9)+(S9) TA102 受试物 自发回变 溶剂对照 阳性物对照
表1 Ames试验菌株的回变结果（平均值±标准差） TA102 组别 剂量 (mg/皿) TA97 -( S9) +( S9) TA98 -( S9) +( S9) TA100 -( S9) +( S9) -( S9) +( S9) 受试物 自发回变 溶剂对照 阳性物对照