实验十七、实时荧光PCR检 测沙门氏菌(salmonella.spp)
实验十七、实时荧光PCR检 测沙门氏菌(salmonella .spp)
一、实验目的： 学习采用实时荧光PCR仪检测食品、化妆品 等中的沙门氏菌(salmonella.spp)的特异检测。 ■二、实验原理： ■试剂盒采用PCR方法结合荧光探针的体外扩 增和检测技术，适用于食品、卫生防疫、化妆 品等沙门氏菌(salmonella.spp)的特异检测
◼ 一、实验目的： ◼ 学习采用实时荧光PCR仪检测食品、化妆品 等中的沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测。 ◼ 二、实验原理： ◼ 试剂盒采用PCR 方法结合荧光探针的体外扩 增和检测技术，适用于食品、卫生防疫、化妆 品等沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测
三、仪器与试剂 1、试剂盒组成 ■DNA提取液 PCR反应液 Tag酶 ■UNG酶阳性对照阴性对照 ■2、仪器 Roche lightcycler,.ABl系列MJ opticon2,Bio Rad/博日Iine-gene荧光PCR检测仪
三、仪器与试剂 ◼ 1、试剂盒组成 ◼ DNA提取液 ◼ PCR反应液 ◼ Taq 酶 ◼ UNG酶阳性对照阴性对照 ◼ 2、仪器 ◼ Roche lightcycler, ABI系列/MJ opticon2，BioRad/博日line-gene荧光PCR检测仪
四、实验步骤 样品的收集及处理以及增菌培养 严格按照无菌操作规程称取25g样品按国标法进行增菌 培养。增菌样品可暂存4℃冰箱，24小时内检验。 ■使用方法（使用前请仔细阅读本操作流程） 1、增菌液处理（样本处理区） 增菌液的处理可以采取以下方法： 取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中， 8,000rpm离心5min,尽量吸弃上清；加入50 ul DNA提 取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀 后沸水浴5min,13,000rpm离心5min,取上清保存于- 20℃备用以待检测
四、实验步骤 ◼ 样品的收集及处理以及增菌培养 ◼ 严格按照无菌操作规程称取25g样品按国标法进行增菌 培养。增菌样品可暂存4℃冰箱，24小时内检验。 ◼ 使用方法（使用前请仔细阅读本操作流程） ◼ 1、增菌液处理（样本处理区） ◼ 增菌液的处理可以采取以下方法： ◼ 取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中， 8,000rpm离心5min，尽量吸弃上清；加入50ul DNA提 取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀 后沸水浴5min，13,000rpm离心5min，取上清保存于- 20℃备用以待检测
2、扩增试剂准备(PCR前准备区) 从试剂盒中取出PCR反应液，室温融化并振荡混匀，取出Tag 酶及UNG酶，每一次使用时2000rpm离心10sec,以收集粘在 管壁上的酶贮液。 设所需要的PCR反应管管数为(n=1管阴性对照+1管阳性 对照+样本数)，每个测试反应体系配制如下表： 试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG酶 用量(L) 22.5 0.5 0.06 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，颠倒混匀， 2000rpm离心10sec,向设定的n个PCR反应管中分别加入 23u,一转移至样本处理区
◼ 2、扩增试剂准备（PCR 前准备区） ◼ 从试剂盒中取出PCR 反应液，室温融化并振荡混匀，取出Taq 酶及UNG酶，每一次使用时2000rpm离心10sec，以收集粘在 管壁上的酶贮液。 ◼ 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 1管阴性对照+ 1管阳性 对照+样本数），每个测试反应体系配制如下表： ◼ 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，颠倒混匀， 2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入 23ul，转移至样本处理区。 试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG酶 用量(μL) 22.5 0.5 0.06
3、加样（样本处理区》 若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温 解冻，以13,000rpm离心5min。 ■ 阴、阳性对照使用前置室温解冻，混匀。 ■向所设定的个PCR反应管中分别加入步骤1中 处理过的样本各2U,阴性对照、阳性对照解 冻后取2u加入相应的反应管中，盖紧管盖， 将PCR反应管转移至检测区，置于PCR仪上， 记录样本摆放顺序
3、加样（样本处理区） ◼ 若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温 解冻，以13,000rpm 离心5min。 ◼ 阴、阳性对照使用前置室温解冻，混匀。 ◼ 向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中 处理过的样本各2ul，阴性对照、阳性对照解 冻后取2ul加入相应的反应管中，盖紧管盖， 将PCR反应管转移至检测区，置于PCR仪上， 记录样本摆放顺序
4、PCR扩增（检测区》 Roche仪器：A.循环条件设置 Progra Cycle Program Incubation Temperature Acquisitio Analysis m Temperat Time(min:sec) transition n Mode Mode ure (C Rate(C/sec) 1 37 5:00 20 none none 2 93 3:00 20 none none 3 40 93 5 20 none quantifi cation 60 40 20 single quantifi cation 20 none none
4、PCR 扩增（检测区） ◼ Roche仪器：A.循环条件设置 Progra m Cycle s Program Temperat ure (℃ Incubation Time(min:sec) Temperature transition Rate(℃/sec) Acquisitio n Mode Analysis Mode 1 1 37 5:00 20 none none 2 1 93 3:00 20 none none 3 40 93 5 20 none quantifi cation 60 40 20 single quantifi cation 4 1 40 0 20 none none
B.仪器检测通道选择：选择F1通道。 ◆ 其它荧光PCR仪： ■37℃：5min,1个循环；95C:3min,1个循 环 e 95℃：5SeC,60C:40sec(收集荧光)，40个循 环。反应体系设为25u。 ■对于多通道荧光PCR仪，荧光信号收集时设定 为Fam荧光素。 ■荧光PCR仪的使用请参阅详细使用手册
◼ B.仪器检测通道选择：选择 F1 通道。 ◼ 其它荧光PCR仪： ◼ 37℃：5 min，1个循环；95℃：3 min, 1个循 环； ◼ 95℃：5 sec, 60℃: 40 sec(收集荧光), 40个循 环。反应体系设为25ul。 ◼ 对于多通道荧光PCR仪，荧光信号收集时设定 为Fam荧光素。 ◼ 荧光PCR仪的使用请参阅详细使用手册
五、结果分析条件设定 ■1、使用Roche荧光PCR检测仪 ■选择F1或F1/F2通道（建议选择F1/F2通道），点击 Quantification进入定量分析窗口。 ■2、在Quantification窗口中，设定Analysis方式为 Fit points,Adjustment方式为proportional;选定 Noise band项，阈值(Noise band cursor)设定以 刚超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线） 的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据 仪器的实际情况进行调整
五、结果分析条件设定 ◼ 1、使用Roche 荧光PCR检测仪 ◼ 选择F1或F1/F2通道（建议选择F1/F2通道），点击 Quantification 进入定量分析窗口。 ◼ 2、在 Quantification 窗口中，设定 Analysis 方式为 Fit points , Adjustment 方式为proportional；选定 Noise band 项，阈值（Noise band cursor）设定以 刚超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线） 的最高点，且 Ct 值不出现任何数值为准，也可根据 仪器的实际情况进行调整
五、结果分析条件设定 使用ABI系列荧光PCR检测仪进行结果分析时基线 (baseline)的确定：取310或3一15个循环的荧光信 号。阈值threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性 对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现 Ct值为准。 使用博日Line-Gene荧光PcR检测仪时，在运行扩增程序 前，先把增益值调至30左右。运行结束后点击数据分析进 入结果分析界面，选择样点拟合法进行结果分析：零点调 整取1一10或1一15个循环的荧光信号；在噪声容限第面 下调整基线位置，其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性 对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为准，选择定 量分析，对样本进行结果分析。 使用MJ Opticon系列荧光PCR检测仪进行结果分析时， 先扣除本底信号后再输入1一10或1二15之间的荧光密度值 来手动设置ct值或拖动Ct线到合适的位置来确定ct值
五、结果分析条件设定 ◼ 使用ABI系列荧光PCR 检测仪进行结果分析时基线 （baseline）的确定：取3—10 或3—15 个循环的荧光信 号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性 对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现 Ct值为准。 ◼ 使用博日Line-Gene荧光PCR检测仪时，在运行扩增程序 前，先把增益值调至30左右。运行结束后点击数据分析进 入结果分析界面，选择样点拟合法进行结果分析：零点调 整取1－10 或1－15 个循环的荧光信号；在噪声容限界面 下调整基线位置，其设定原则以阈值线刚好超过正常阴性 对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点为准，选择定 量分析，对样本进行结果分析。 ◼ 使用MJ Opticon 系列荧光PCR检测仪进行结果分析时， 先扣除本底信号后再输入1－10或1－15之间的荧光密度值 来手动设置ct值或拖动Ct线到合适的位置来确定ct值