实验十五、水产品中孔雀石 绿和结晶紫残留量的测定 标准依据： GB/T19857一2005水产品中孔雀石绿和结晶 紫残留量的测定
实验十五、水产品中孔雀石 绿和结晶紫残留量的测定 标准依据: GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶 紫残留量的测定
实验目的 ■} 学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石 绿(Leucomalachite green)、结晶紫及其代 谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的 高效液相色谱的测定方法
一、实验目的 ◼ 学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石 绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其代 谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的 高效液相色谱的测定方法。 ◼
二、实验原理 m 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提 取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层 并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色 谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量
二、实验原理 ◼ 试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提 取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层 并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色 谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量
三、实验试剂与仪器 (一)试剂 (除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。) 1、乙腈：液相色谱纯。 2、二氯甲烷。 3、甲醇：液相色谱纯。 ◆ 4、乙酸盐缓冲液。 5、20%盐酸羟胺溶液。 6、1.0moL对-甲苯磺酸 ◆ 7、二甘醇。 8、酸性氧化铝：80-120目。 9、二氧化铅。 10、硅藻土545：色谱层析级。 11、标准品：孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结 晶紫(LCV),纯度大于98%。 12、标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫， 用乙腈分别配制成100ug/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1μg/mL的标准溶液。 -18℃避光保存。 13、混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液(3.2.13)，配制成每毫升含孔雀石绿、 隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。-18C避光保存
三、实验试剂与仪器 ◼ （一）试剂 ◼ (除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。) ◼ 1、乙腈：液相色谱纯。 ◼ 2、二氯甲烷。 ◼ 3、甲醇：液相色谱纯。 ◼ 4、乙酸盐缓冲液。 ◼ 5、20%盐酸羟胺溶液。 ◼ 6、1.0 mol/L对-甲苯磺酸。 ◼ 7、二甘醇。 ◼ 8、酸性氧化铝：80-120目。 ◼ 9、二氧化铅。 ◼ 10、硅藻土545：色谱层析级。 ◼ 11、标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结 晶紫（LCV），纯度大于98%。 ◼ 12、标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫， 用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。 -18℃避光保存。 ◼ 13、混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、 隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。-18℃避光保存
(二)仪器和设备 1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。 2、匀浆机。 ■3、离心机：4000r/min。 ■4、固相萃取装置。 ■5、25%PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm×4mmi.d, 两端附2um过滤板，抽真空下，填装含有25%PbO2的 硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲 洗。并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相 色谱柱之间。 6、酸性氧化铝柱：1g/3mL,使用前用5mL乙腈活化
（二）仪器和设备 ◼ 1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。 ◼ 2、匀浆机。 ◼ 3、离心机：4 000 r/min。 ◼ 4、固相萃取装置。 ◼ 5、25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm4mm i.d)， 两端附2m过滤板，抽真空下，填装含有25% PbO2的 硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。临用前用甲醇冲 洗。并将PbO2氧化柱连接在紫外-可见光检测器与液相 色谱柱之间。 ◼ 6、酸性氧化铝柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化
四、 实验步骤： ◆ (一)样品制备 提取 称取5.00g样品于50mL离心管内，加入1.5L20%的盐酸羟胺溶液、 2.5mL1.0mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液，用匀 浆机以10000 r/min的速度均质30s,加入10mL乙腈刷烈震摇30s。 加入5g酸性氧化铝，再次震荡30s。,3000 r/min离心10min。把上 清液转移至装有10mL水和2mL二甘醇的100mL离心管中。然后在 50mL离心管中加入10mL乙腈，重复上还操作，合并乙腈层。 净化 在离心管中加入15mL二氯甲烷，振荡10s,3000 r/min离心10min, 将二氯甲烷层转移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL兰 氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100L梨形瓶中。 45℃旋转蒸发至约1mL,用2.5mL乙腈溶解残渣。 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转 移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5L,把选涤液依次通过柱， 控制流速不超过0.6 mL/min,收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干， 残液准确用0.5mL乙腈溶解，过0.45m滤膜，滤液供液相色谱测定
四、实验步骤: ◼ （一）样品制备 提取 ◼ 称取5.00 g样品于50 mL离心管内，加入1.5 mL 20%的盐酸羟胺溶液、 2.5 mL 1.0 mol/L的对-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸盐缓冲溶液，用匀 浆机以10 000 r/min的速度均质30 s，加入10 mL乙腈剧烈震摇30 s。 加入5g酸性氧化铝，再次震荡30 s。 3 000 r/min离心10 min。把上 清液转移至装有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL离心管中。然后在 50 mL离心管中加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈层。 净化 ◼ 在离心管中加入15 mL 二氯甲烷,振荡10 s， 3 000 r/min离心10 min， 将二氯甲烷层转移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二 氯甲烷重复上述操作一次，合并二氯甲烷层于100 mL梨形瓶中。 45℃旋转蒸发至约1 mL，用2.5 mL乙腈溶解残渣。 ◼ 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上，将梨形瓶中的溶液转 移到柱上，再用乙腈洗涤瓶两次，每次2.5 mL, 把洗涤液依次通过柱， 控制流速不超过0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至近干， 残液准确用0.5 mL乙腈溶解，过0.45μm 滤膜，滤液供液相色谱测定
(二)色谱分析 1、液相色谱条件 a)色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.),粒度 5um,在C18色谱柱和检测器之间连接25%PbO2氧 化柱： b)流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液(3.2.7，梯度洗脱 参数见表1： 流速：1.0mLu/min; 柱温：室温； ■检测波长：618nm(孔雀石绿)；588nm(结晶紫)： ■进样量：50L
（二）色谱分析 ◼ 1、液相色谱条件 ◼ a) 色谱柱： C18柱，250 mm 4.6mm（i.d.）， 粒度 5μm，在C18色谱柱和检测器之间连接25% PbO2氧 化柱; ◼ b) 流动相：乙腈和乙酸铵缓冲溶液 (3.2.7),梯度洗脱 参数见表1； ◼ 流速：1.0 mL/min； ◼ 柱温：室温； ◼ 检测波长：618 nm(孔雀石绿); 588 nm(结晶紫)； ◼ 进样量：50 μL
2、液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准 工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐 色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在 仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等 体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石 绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留 时间约为6.10min、7.88min、17.77min、 18.22min,标准品色谱图参见附录。 ■空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进 行
2、液相色谱测定 ◼ 根据样液中被测孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫或隐色结晶紫含量情况，选定峰高相近的标准 工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐 色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫响应值均应在 仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等 体积参插进样测定。在上述色谱条件下，孔雀石 绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留 时间约为6.10min、7.88min、17.77min、 18.22min，标准品色谱图参见附录。 ◼ 空白试验：除不加试样外，均按上述测定步骤进 行
五、计算 结果计算和表述 ◆ 蓬于暴其●靓塞召餐： 隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留 X∈CxAxV/AsxW 式中： X-样品中待测组分残留量，mgkg: C-待测组分标准工作液的浓度，μg/mL: A-样品中待测组分的峰面积： As-待测组分标准工作液的峰面积： V-样液最终定容体积，mL: W-最终样液所代表的试样量，g。 测定结果的表述 奢凌盈套禹经期我图凳翠容镶餐系指孔雀石绿和它的代物隐色孔雀 查镇清萝朝养明鑫留蒙裂票结哭系指结品聚和它的代时物险色结品紫残 方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为 2.0ug/kg
五、计算 ◼ 结果计算和表述 ◼ 按下式计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留 量。计算结果需扣除空白值。 ◼ X= CAV/ AsW ◼ 式中： ◼ X- 样品中待测组分残留量， mg/kg； ◼ C- 待测组分标准工作液的浓度,μg/mL； ◼ A- 样品中待测组分的峰面积； ◼ As- 待测组分标准工作液的峰面积； ◼ V- 样液最终定容体积， mL； ◼ W- 最终样液所代表的试样量, g。 ◼ 测定结果的表述 ◼ 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀 石绿残留量的之和，以孔雀石绿表示。 ◼ 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残 留量的之和，以结晶紫表示。 ◼ 方法检测限 ◼ 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为 2.0µg/kg
孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫标准的液相色谱图 结晶紫 隐色结晶紫 AU 孔雀石绿 隐色孔雀石绿 0.00 5.00 10.00 15.00 t/min
孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫标准的液相色谱图