实验十三、蔬菜中有机磷和氨基 申酸酯类农药残留量的快速检测 标准依据： GB/T5009.199-2003蔬菜中有机磷和氨基甲酸 酯类农药残留量的快速检测
实验十三、蔬菜中有机磷和氨基 甲酸酯类农药残留量的快速检测 标准依据: GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸 酯类农药残留量的快速检测
方法一快速卡法 一、 目的要求：学习快速卡法测定有机磷农残快速检 验法及熟悉检验结果评定。 ■二、实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色） 水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类 农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的 过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有 机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。 ■三、实验试剂： ■1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片； 2、pH7.5磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠 [Na2HPO412H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4] 用500mL蒸馏z水溶解
方法一 快速卡法 ◼ 一、目的要求：学习快速卡法测定有机磷农残快速检 验法及熟悉检验结果评定。 ◼ 二、实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色） 水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类 农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的 过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有 机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。 ◼ 三、实验试剂： ◼ 1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片； ◼ 2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠 [Na2HPO4•12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]， 用500 mL蒸馏水溶解
四、实验步骤： ■1、整体测定法 (1)选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土， 剪成1cm左右方形碎片，取5g防入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上， (2)取一片快速卡，用白色药片沾取提取液，放置 10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中 放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。 :(3)将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温 3min,使红色药片与白色药片叠合发生反应。 ■注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照
四、实验步骤： ◼ 1、整体测定法 ◼ （1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土， 剪成1cm左右方形碎片,取5g防入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上. ◼ (2) 取一片快速卡，用白色药片沾取提取液，放置 10min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中 放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。 ◼ （3）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温 3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。 ◼ 注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照
■2、表面测定法（粗筛法〉 (1)擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴缓冲液在 蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。 (2)取一速片测卡，将蔬菜上的液滴滴在白 色药片上。 :(3)放置10min以上进行预反应，有条件时 在37℃恒温装置中放置10min。预反应10 min,预反应后的药片表面必须保持湿润。 (4)将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装 置恒温3min,使红色药片与白色药片叠合发生 反应。 注意： 每批测定应设一个缓冲液的空白对照
◼ 2、表面测定法（粗筛法） ◼ （1）擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴缓冲液在 蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。 ◼ （2）取一速片测卡，将蔬菜上的液滴滴在白 色药片上。 ◼ （3）放置10 min以上进行预反应，有条件时 在37 ℃恒温装置中放置10 min。预反应10 min，预反应后的药片表面必须保持湿润。 ◼ （4）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装 置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生 反应。 ◼ 注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照
五、检测结果判断 ■1、结果判断 ·结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制 (为阳性)、未抑制（阴性）表示。 ■与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅 蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与 空白对照卡相同，为阴性结果。 对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确 定具体农药品种和含量。 2、样品检测结果记录并对检测结果进行评价
五、检测结果判断 ◼ 1、结果判断 ◼ 结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制 （为阳性）、未抑制（阴性）表示。 ◼ 与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅 蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与 空白对照卡相同，为阴性结果。 ◼ 对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确 定具体农药品种和含量。 ◼ 2、样品检测结果记录并对检测结果进行评价
六、实验注意事项及说明 1、速测卡法符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱 法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。 2、葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对 酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取 整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬 菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。 量 3、当温度条件低于37℃，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置 反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手 指（体温）捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时 间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色 的原因：一是药片表面缓冲溶液加得少、预反应后的药片表面不够 湿润：二是温度太低。 4、红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3min后的蓝 色会逐渐加深，24h后颜色回逐渐退去
六、实验注意事项及说明 ◼ 1、速测卡法符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱 法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。 ◼ 2、葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对 酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取 整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬 菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。 ◼ 3、当温度条件低于37℃，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置 反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手 指（体温）捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时 间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色 的原因：一是药片表面缓冲溶液加得少、预反应后的药片表面不够 湿润；二是温度太低。 ◼ 4、红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3 min后的蓝 色会逐渐加深，24h后颜色回逐渐退去
方法二酶抑制率法 (分光光度法) 目的要求 学习酶抑制率法测定果蔬有机磷和氨基甲 酸脂类农药残留的原理和方法，注意实验过程 的操作要点
方法二 酶抑制率法（分光光度法） ◼ 一、目的要求 学习酶抑制率法测定果蔬有机磷和氨基甲 酸脂类农药残留的原理和方法，注意实验过程 的操作要点
二、实验原理 根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶 的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘 化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机 磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就 不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产 物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提 取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底 物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化 很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测 仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬 菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况
二、实验原理 ◼ 根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶 的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘 化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机 磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就 不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产 物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提 取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底 物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化 很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测 仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬 菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况
三、实验试剂和仪器 (一)试剂 1、 pH8.0缓冲液： ■2、乙酰胆碱酯酶 (实验专用酶)； ■3、底物碘化乙酰硫代胆碱；（保存期不超过2周》 ■4、 显色剂： 5、可选用由以上试剂配置的试剂盒。 ■（二）仪器 ■1、分光光度计或相应的农残快速检测仪： ■2、天平(0.01g): ■3、恒温水浴或恒温培养箱
三、实验试剂和仪器 ◼ （一）试剂 ◼ 1、pH8.0缓冲液； ◼ 2、乙酰胆碱酯酶（实验专用酶）； ◼ 3、底物碘化乙酰硫代胆碱；（保存期不超过2周） ◼ 4、显色剂； ◼ 5、可选用由以上试剂配置的试剂盒。 ◼ （二）仪器 ◼ 1、分光光度计或相应的农残快速检测仪； ◼ 2、天平（0.01g）； ◼ 3、恒温水浴或恒温培养箱
四、实验步骤 1、样品处理 选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲 洗掉表面泥土，剪成1cm左右碎片。取样品1g,放入烧杯或提取 瓶中，加入5mL缓冲液，振荡12min,倒出提取液，静置35min, 待用。 2、对照溶液测试 先于试管中加入2.5mL缓冲液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色 剂。摇匀后于37℃放置15min以上（每批样品的控制时间应一致）。 加入0.1L低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿 中，记录反应3min的吸光度的变化值△Ao。 3、样品溶液测定 先于试管中加入2.5L样品提取液，其他操作与对照测定相同，记 录反应3min的吸光度的变化值△At
四、实验步骤 ◼ 1、样品处理 ◼ 选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲 洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取 瓶中，加入5 mL缓冲液，振荡1~2 min，倒出提取液，静置3~5 min， 待用。 ◼ 2、对照溶液测试 ◼ 先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色 剂。摇匀后于37 ℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。 加入0.1 mL低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿 中，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA0。 ◼ 3、 样品溶液测定 ◼ 先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记 录反应3 min的吸光度的变化值ΔAt