第十一章维生素的测定 第一节概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确 认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。维生素的命 名多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B,、维生素C等。也有根 据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，或按照其化学结构如视黄醇、硫 胺素等。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各 ,但都有以下共同特点：它们或 前体化合物都在天然食物中存在：不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功 能是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量极少：一般在体内不能合成，或合成量不能 满足生理需要，必须经常从食物中摄取：长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病，但 是，摄入量过多，超过非生理量时，可导致体内积存过多而引起中毒。 食品中维生素的含量主要取决于食品的品种及该食品的加工工艺与贮存条件.许多维 素对光、热、氧、PH值敏感。在正常摄食条件下，没有任何一种食物含有可满足人体所 要的全部维生素，人们必须在日常生活中合理调配饮食结构，来获得适量的各种维生素。测 定食品中维生素的含量，在评价食品的营养价值，开发利用富含维生素的食品资源，指导人 们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症，研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性， 指导人们制定合 理的 工艺及贮存条件，监督维生素强化食品的强化剂量，防止因掇 入过多而 引起维生素中等方面 具有十分重要的意义和作用 按照维生素的溶解性能，习惯上将其分为两大类：脂溶性维生素和水溶性维生素。前者 能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K各小类，其 共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中青：后者 般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都 二类维生素的分布见表11一1。 表11一1维生素的类别 名称 英文名 维生素A(A、A) Vitamin A(A retinol) 溶性维生索 维生素D(D2、D、D4Ds) Vitamin D,cholecalciferol calciforol 维生素E(a-,B-,Y-,8等八种) Vitamin E,a-tocopherol 维生素KK.K) Vitamin K (K:phylloquinone,K2:farnoquinone) 维生素B族 Vitamin B complex 维生素B,(硫胺素) Vitamin B.thiamine,aneurin 雏生素B:(核黄素) Vitamin B2.riboflavin 维生素B:(泛酸、遍多酸) Vitamin B3.pantothenic acid 性维生素 维生素B( 尼克酰胺， Vitamin iacin Vitamin B6,pyridoxin 维生素B,(生物素 Vitamin B7.vitaminH.biotin 维生素B1(叶酸) Vitamin Bu,folic acid,folacin Pterovl glutamic acid 维生素B12(钴维生素) Vitamin B2.cobalamins 维生素C
1 第十一章 维生素的测定 第一节 概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确 认的有 30 余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有 20 余种。维生素的命 名多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素 A、维生素 B1、维生素 C 等。也有根 据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，或按照其化学结构如视黄醇、硫 胺素等。这些维生素结构复杂、理化性质及生理功能各异，但都有以下共同特点：它们或其 前体化合物都在天然食物中存在；不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功 能是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量极少；一般在体内不能合成，或合成量不能 满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病，但 是，摄入量过多，超过非生理量时，可导致体内积存过多而引起中毒。 食品中维生素的含量主要取决于食品的品种及该食品的加工工艺与贮存条件。许多维生 素对光、热、氧、PH 值敏感。在正常摄食条件下，没有任何一种食物含有可满足人体所需 要的全部维生素，人们必须在日常生活中合理调配饮食结构，来获得适量的各种维生素。测 定食品中维生素的含量，在评价食品的营养价值，开发利用富含维生素的食品资源，指导人 们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症，研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性， 指导人们制定合理的工艺及贮存条件，监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而 引起维生素中毒等方面，具有十分重要的意义和作用。 按照维生素的溶解性能，习惯上将其分为两大类：脂溶性维生素和水溶性维生素。前者 能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括 A、D、E、K 各小类，其 共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；后者 溶于水，包括 B、C 各小类，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都 能从机体排出。二类维生素的分布见表 11－1。 表 11－1 维生素的类别 名称 英文名 脂 溶 性 维 生 素 维生素 A（A1、A2） 维生素 D（D2、D3、D4、D5） 维生素 E（α-，β-，γ-，δ 等八种） 维生素 K(K1,K2) Vitamin A (A1 名 retinol) Vitamin D, cholecalciferol calciforol Vitamin E,α-tocopherol Vitamin K（K1:phylloquinone, K2:farnoquinone） 水 溶 性 维 生 素 维生素 B 族 维生素 B1（硫胺素） 维生素 B2（核黄素） 维生素 B3（泛酸、遍多酸） 维生素 B5（ 酰胺、尼克酰胺） 维生素 B6（吡哆素） 维生素 B7（生物素） 维生素 B11（叶酸） 维生素 B12（钴维生素） 维生素 C Vitamin B complex Vitamin B1,thiamine,aneurin Vitamin B2,riboflavin Vitamin B3,pantothenic acid Vitamin B5,nicotinamide,niacin Vitamin B6,pyridoxine Vitamin B7,vitaminH,biotin Vitamin B11,folic acid, folacin Pteroyl glutamic acid Vitamin B12,cobalamins Vitamin C, ascorbic acid
维生素的分析方法有生物鉴定法、微生物法、化学法和仪器法。生物鉴定法不但非常费 时(21天)、费力，而且需要有动物饲养设施和场地 般仅在没有其他合适的可选方法 或者要求测定 分析样 的生物利用率的情况下才使用。微 生物 法是基] 生长 的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，样品不需经化学致性，但费时较长， 仅限于水溶性维生素的测定。仪器分析方法中，有荧光法、分光光度法、色谱法、酶法、免 疫法等多种方法，它们快速、灵敏、有较好的选择性。荧光法用于硫胺素的测定具有良好的 准确性与灵敏府，日经济、简便、省时，被闲内外一泛作为标准测定方法。HPLC可用于大 多数维生素的分析，并且在某些条件下可同时分析几种 素或同效维生素（维生素的 体)，但分析费用较高。不同的分析方法所适用的食品基质有所区别，在选择分析方法应予 以注意。食品中维生素含量的表示，一般均以质量表示。 本章主要介绍食品中比较常见的几种维生素的测定。 第二节脂溶性维生素的测定 食物中的脂溶性维生素常与类脂物质共存，摄入时一道被人体吸收。脂溶性维生素具有 以下的理化性质： 1,溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易落于脂肪、丙酮、三氯甲烷、乙酥、苯、乙解 等有机溶剂。 耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定：维生素E在无氧情况下，对热 酸、碱稳定。维生素K对酸、碱都不稳定。 3.耐热、耐光、耐氧化性：维生素A、D、E、K耐热性都好，但维生素A易被氧化， 光和热会促进其氧化。维生素D性质稳定，不易被氧化。维生素E容易被氧化，对可见光 稳定但易被紫外线破坏。维生素K对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏。 根据上述性质 ,测定脂溶性维生素时通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后 用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。在皂化和浓缩 时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等）。对于某 些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。 对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。 高效液相伍普法(H可C)别定含物维生老A、F的含量 维生素A又名视黄醇 只存在于动物组织中，在植物体内则以胡萝卜素的形式存在 维生素A为条状淡黄色晶体，熔点62~64℃，不溶于水，能溶于乙醇、甲醇、氯仿、乙醚 和苯等有机溶剂。易被氧化破坏，对酸不稳定，但却经得起沸腾的碱处理。 维生素A有许多异构休，在动物的脂肪中存在的维生素A的母体化合物称为视黄醇， 即维生素A,其结构式为： CH, CH.OH 维生素A,(视黄醇 在鱼肝油中存在 一种类视黄醇物质，其生物效能为视黄醇的40%，在3位上脱氢， 称作3一脱氢视黄醇，又称作维生素A2,其结构式为：
2 维生素的分析方法有生物鉴定法、微生物法、化学法和仪器法。生物鉴定法不但非常费 时（21 天）、费力，而且需要有动物饲养设施和场地，一般仅在没有其他合适的可选方法， 或者要求测定分析样品的生物利用率的情况下才使用。微生物法是基于微生物生长需要特定 的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，样品不需经化学改性，但费时较长， 仅限于水溶性维生素的测定。仪器分析方法中，有荧光法、分光光度法、色谱法、酶法、免 疫法等多种方法，它们快速、灵敏、有较好的选择性。荧光法用于硫胺素的测定具有良好的 准确性与灵敏度，且经济、简便、省时，被国内外广泛作为标准测定方法。HPLC 可用于大 多数维生素的分析，并且在某些条件下可同时分析几种维生素或同效维生素（维生素的异构 体），但分析费用较高。不同的分析方法所适用的食品基质有所区别，在选择分析方法应予 以注意。食品中维生素含量的表示，一般均以质量表示。 本章主要介绍食品中比较常见的几种维生素的测定。 第二节 脂溶性维生素的测定 食物中的脂溶性维生素常与类脂物质共存，摄入时一道被人体吸收。脂溶性维生素具有 以下的理化性质： 1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、三氯甲烷、乙醚、苯、乙醇 等有机溶剂。 2． 耐酸碱性：维生素 A、D 对酸不稳定，对碱稳定；维生素 E 在无氧情况下，对热、 酸、碱稳定。维生素 K 对酸、碱都不稳定。 3． 耐热、耐光、耐氧化性：维生素 A、D、E、K 耐热性都好，但维生素 A 易被氧化， 光和热会促进其氧化。维生素 D 性质稳定，不易被氧化。维生素 E 容易被氧化，对可见光 稳定但易被紫外线破坏。维生素 K 对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏。 根据上述性质，测定脂溶性维生素时通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后 用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。在皂化和浓缩 时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等）。对于某 些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。 对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。 一. 高效液相色谱法（HPLC）测定食物中维生素 A、E 的含量 维生素 A 又名视黄醇，只存在于动物组织中，在植物体内则以胡萝卜素的形式存在。 维生素 A 为条状淡黄色晶体，熔点 62～64℃，不溶于水，能溶于乙醇、甲醇、氯仿、乙醚 和苯等有机溶剂。易被氧化破坏，对酸不稳定，但却经得起沸腾的碱处理。 维生素 A 有许多异构体，在动物的脂肪中存在的维生素 A 的母体化合物称为视黄醇， 即维生素 A1，其结构式为： C H 2 C H 3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 2 O H 维生素 A1(视黄醇) 在鱼肝油中存在一种类视黄醇物质，其生物效能为视黄醇的 40％，在 3 位上脱氢， 称作 3－脱氢视黄醇，又称作维生素 A2，其结构式为：
% CH2OH 维生素A 维生素E又称生育酚，属于酚类物质。目前已经确认的有八种异构体：ā一、B一 Y一、6一生有酚和4一、B一、Y一、8一生有三烯酚。其中以4一生有酚的活性最高， 若以a一生有酚的生理活性为100，则B一及y一生有酚和8一生有三烯酚的活性分别为 40、8及20，其他形式的活性更低。故通常都以。一生育酚作为维生素E的代表进行研究 生有酚和生有三烯前之间的区别在于后者的侧链上有三个双键，不同生有酚或生有三烯酚之 间的区别是环状结构上的甲基的数目和位置不同。他们的结构式如下： 35 CH. HO CH3 CH, 生有酚 R2 CH. HO CHa CH. 生育三烯酚 化合物 Ri R2 R3 a-生有酚 CH.CH. CH B-生育酚 CH CH 一生有酚 H CH 6-生有酚 维生素E为黄色油状液体，溶于脂溶性溶剂，对热稳定，在酸性环境比碱性环境稳定。 在无氧条件下，对热与光以及对碱性环境也相对较为稳定。 维生素E广泛分布于动、植物食品中，含量较多的为各种粮食的胚和植物油，如麦胚油、 棉籽油、 玉米油、花生油、大豆油和芝麻油。莴苣叶和柑橘皮含量也多。几乎所有绿叶植物 都含有维生素。此外，肉、窝、蛋、乳、豆类及鱼肝油中也都含有维生素 (一)原理 样品中维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂 中。用高效液相色谱法C1:反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器，用内标法 定量测定 二)样品处理 1.皂化称取适量样品（含维生素A约3μg,维生素E各异构体约40μg)于三角瓶 中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散。加入5mL100gL抗坏血酸溶液和2.00mL苯并[e] 花溶液(5μg/L,内标用)，混匀，加10mL氢氧化钾溶液(50%浓度)，混匀，于沸水浴上 回流30min,使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。 2.提取将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50L水分2一3次洗皂化瓶，洗液并入分 液漏斗中。用100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振据分 液漏斗2血in,静置分层，弃去水层。然后每次用约100L水将乙醚液洗至中性，约4-5次。 3.浓缩将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g)滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙 3
3 CH3 H C CH3 3 CH3 CH3 CH2OH 维生素 A2 维生素 E 又称生育酚，属于酚类物质。目前已经确认的有八种异构体：α－、β－、 γ－、δ－生育酚和 α－、β－、γ－、δ－生育三烯酚。其中以 α－生育酚的活性最高， 若以 α－生育酚的生理活性为 100，则 β－及 γ－生育酚和 δ－生育三烯酚的活性分别为 40、8 及 20，其他形式的活性更低。故通常都以 α－生育酚作为维生素 E 的代表进行研究。 生育酚和生育三烯酚之间的区别在于后者的侧链上有三个双键，不同生育酚或生育三烯酚之 间的区别是环状结构上的甲基的数目和位置不同。他们的结构式如下： O CH3 CH3 CH3 CH3 H3C R1 R3 R2 HO 生育酚 O CH3 CH3 CH3 CH3 H3C R1 R3 R2 HO 生育三烯酚 化合物 R1 R2 R3 α-生育酚 CH3 CH3 CH3 β-生育酚 CH3 H CH3 γ-生育酚 H CH3 CH3 δ-生育酚 H H CH3 维生素 E 为黄色油状液体，溶于脂溶性溶剂，对热稳定，在酸性环境比碱性环境稳定。 在无氧条件下，对热与光以及对碱性环境也相对较为稳定。 维生素 E 广泛分布于动、植物食品中，含量较多的为各种粮食的胚和植物油，如麦胚油、 棉籽油、玉米油、花生油、大豆油和芝麻油。莴苣叶和柑橘皮含量也多。几乎所有绿叶植物 都含有维生素 E。此外，肉、禽、蛋、乳、豆类及鱼肝油中也都含有维生素 E。 （一）原理 样品中维生素 A 及维生素 E 经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂 中。用高效液相色谱法 C18 反相柱将维生素 A 和维生素 E 分离，经紫外检测器，用内标法 定量测定。 （二）样品处理 1.皂化 称取适量样品（含维生素 A 约 3μg，维生素 E 各异构体约 40μg）于三角瓶 中，加 30mL 无水乙醇，振摇使样品分散。加入 5mL100g/L 抗坏血酸溶液和 2.00mL 苯并[e] 芘溶液（5μg/L，内标用），混匀，加 10mL 氢氧化钾溶液（50％浓度），混匀，于沸水浴上 回流 30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。 2.提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用 50mL 水分 2－3 次洗皂化瓶，洗液并入分 液漏斗中。用 100mL 无水乙醚分 2 次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分 液漏斗 2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约 100mL 水将乙醚液洗至中性，约 4－5 次。 3.浓缩 将乙醚提取液经无水硫酸钠（约 5g）滤入 150mL 旋转蒸发瓶内，用约 15mL 乙
醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚， 特瓶中乙联剩下约2mL时，取下旅发瓶，用氨气吹干乙球，随即加入2mL乙醇，充分混合 溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中， 于离心机上离心5min(3000r/min),上清液传 色谱分析用。 (三)液相色谱分析 色谱推荐条件： f预柱：0DS10μm,4mm×4.5cm 分析柱：0DS5um.4.6m×25c 流动相：甲醇 水=98：2，混匀，临用前脱气。 紫外检测器波长：300m,量程0.02 进样量：20μL 流速：1.65~1.70mL/min (四)计算 X=p/m×V×100/1000 式中X-某种维生素的含量， mg/100g P-由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL: V一样品浓缩定容体积，L: 四-样品质量，g。 五)过论 1.本法摘自GB12388一90，适用于各种食物和饲料中维生素A和E的同时测定。最小 检出限分别为维生素A0.8ng,a一生育酚91.8ng,Y-生育酚36.6ng,8-生有酚20.6ng。 2。定性方法采用标准物色谱图的保留时间定性，定量方法采用内标两点法进行定量计 算。先制备标准曲线，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在 标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。用微处理机二点内标法进行计算时，按 其计算公式由微机直接给出结界 3。实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器，避免维生素的破坏 4.本法不能将β一生育酚和y一生育酚分开，故y一生有酚峰中含有B一生育酚峰。PLC 图谱见图11-1。 5.测定维生素E还有比色法、荧光法等。 图11一1维生素A和维生素E色谱图 、比色法测定维生素A的含最 原理 雏生素A在三氯甲烷中与三氯化悌相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维 生素A的含量成正比，在620nm波长下测定其吸光度
4 醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠 2 次，并入蒸发瓶内，于 55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚， 待瓶中乙醚剩下约 2mL 时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入 2mL 乙醇，充分混合、 溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上离心 5min（3000r/min），上清液供 色谱分析用。 （三）液相色谱分析 色谱推荐条件： 预柱：ODS 10μm,4mm×4.5cm 分析柱：ODS 5μm,4.6mm×25cm 流动相：甲醇：水＝98：2，混匀，临用前脱气。 紫外检测器波长：300nm,量程 0.02 进样量：20μL 流速：1.65～1.70mL/min (四)计算 X=ρ/m×V×100/1000 式中 X - 某种维生素的含量，mg/100g; ρ- 由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL； V – 样品浓缩定容体积，mL； m – 样品质量，g。 （五）讨论 1. 本法摘自 GB 12388－90，适用于各种食物和饲料中维生素 A 和 E 的同时测定。最小 检出限分别为维生素 A 0.8ng，α－生育酚 91.8ng，γ－生育酚 36.6ng,δ-生育酚 20.6ng。 2. 定性方法采用标准物色谱图的保留时间定性，定量方法采用内标两点法进行定量计 算。先制备标准曲线，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在 标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。用微处理机二点内标法进行计算时，按 其计算公式由微机直接给出结果。 3．实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器，避免维生素的破坏。 4．本法不能将β－生育酚和γ－生育酚分开，故γ－生育酚峰中含有β－生育酚峰。HPLC 图谱见图 11－1。 5． 测定维生素 E 还有比色法、荧光法等。 图 11－1 维生素 A 和维生素 E 色谱图 二、比色法测定维生素 A 的含量 （一）原理 维生素 A 在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维 生素 A 的含量成正比，在 620nm 波长下测定其吸光度
(二)测定方法 1.样品处理 维生素A极易枝光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。根据样品性质，可采用皂化 法或研磨法。 皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但操作费时，且 易导致维生素A的损失。操作过程如下：称取0.5~5g样品于锥形瓶中，加入10mL50%氢 氧化钾溶液及20~40mL乙醇，于电热板上回流30min,至皂化完全。将皂化瓶内混合物移 至分液漏斗中，用无水乙醚充分洗涤皂化瓶， 洗液并入分液漏斗内， 将水层与乙醚层分开 水层反复用乙醚抽提直至无维生素A为止。合并醚层后，先用水洗提后 再用0.5mol/L 氧化钾溶液洗涤除去醚溶性酸皂，冉用水洗涤醚层，直至洗涤水不呈碱性（用酚秋指示剂） 为止。将醚层放出，经过无水硫酸钠脱水后，蒸馏浓缩至剩下5mL乙醚时减压抽气至干， 立即加入一定量的三氯甲烷使落液中维生素A含量在话宜范围内，供比色测定。 研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5~1Oug样品的测定，如肝脏等。步骤简单」 省时， 结果准确 操作过程如下：称取 58样品， 放入盛有 5倍样品质量的无水硫酸 钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并匀质化。将全部均质化的样品无损的转移入具 塞的锥形瓶内，加入50~100mL乙醚，振摇抽提，使样品中维生素A溶于乙醚中，然后静 置澄清或离心澄清。取澄清乙醚2~5mL,放入比色管中，在70~80℃水浴中抽气蒸干，立 即加入1mL三氯甲烷溶解，供比色用。 2 标准曲线制备 确取一定量维生素A标准溶液于4~5个容量瓶内，用三氯甲烷配置标准系列。再取 相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标淮系列使用液1mL,各管加入乙酸酐1滴，制成 标准系列，于620m波长处，以三氯甲烷调节零点，将标准比色系列按顺序移入光路前， 迅速加入9ml三氯化锑一三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，绘制标淮曲线。 3.样品测定 比色管中加10mL三氯甲烷，1滴乙酸酐为空白液，另一比色管中加入1mL三氯甲 烷，其它比色管分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐，以下步骤同标准曲线的制备。 (三)计算 x=om×vX100/1000 式中：X一样品中维生素A含量，mg100g(如按国际单位，1IU=0.3ug维生素A) -由标准曲线上查得维生素A的含量，ugmL m一样品质量，g: v一抽取后加三氯甲烷定量的体积，mL: (四)讨论 1.本法摘自GB12388一90，话用于食品中维生素A的测定 2.三氯化锑有腐蚀性，不能粘在手上， 三氯化锑与水能生成白色沉淀，所以不能碰到 水. 3.三氯化锑与维生素A生成的蓝色物质很不稳定，要在6s内完成吸光度的测定，否 则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低。 三、胡萝卜素的测定 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总 称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有B一紫罗宁残基的类 萝卜素。 在人体内 可转移》 维生素A,故称为维生素A原。如α、B、Y胡萝下素，其中以B一胡萝卜素效价最高，B一胡 萝卜素的结构如下：
5 （二）测定方法 1．样品处理 维生素 A 极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。根据样品性质，可采用皂化 法或研磨法。 皂化法适用于维生素 A 含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但操作费时，且 易导致维生素 A 的损失。操作过程如下：称取 0.5～5g 样品于锥形瓶中，加入 10mL50％氢 氧化钾溶液及 20～40mL 乙醇，于电热板上回流 30min，至皂化完全。将皂化瓶内混合物移 至分液漏斗中，用无水乙醚充分洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗内，将水层与乙醚层分开， 水层反复用乙醚抽提直至无维生素 A 为止。合并醚层后，先用水洗提后，再用 0.5mol/L 氢 氧化钾溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚层，直至洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂） 为止。将醚层放出，经过无水硫酸钠脱水后，蒸馏浓缩至剩下 5mL 乙醚时减压抽气至干， 立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素 A 含量在适宜范围内，供比色测定。 研磨法适用于每克样品维生素 A 含量大于 5～10ug 样品的测定，如肝脏等。步骤简单、 省时，结果准确。操作过程如下：称取 2～5g 样品，放入盛有 3～5 倍样品质量的无水硫酸 钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并匀质化。将全部均质化的样品无损的转移入具 塞的锥形瓶内，加入 50～100mL 乙醚，振摇抽提，使样品中维生素 A 溶于乙醚中，然后静 置澄清或离心澄清。取澄清乙醚 2～5mL，放入比色管中，在 70～80℃水浴中抽气蒸干，立 即加入 1mL 三氯甲烷溶解，供比色用。 2．标准曲线制备 准确取一定量维生素 A 标准溶液于 4～5 个容量瓶内，用三氯甲烷配置标准系列。再取 相同数量比色管顺次取 1mL 三氯甲烷和标准系列使用液 1mL，各管加入乙酸酐 1 滴，制成 标准系列，于 620nm 波长处，以三氯甲烷调节零点，将标准比色系列按顺序移入光路前， 迅速加入 9ml 三氯化锑－三氯甲烷溶液，于 6s 内测定吸光度，绘制标准曲线。 3．样品测定 于一比色管中加 10mL 三氯甲烷，1 滴乙酸酐为空白液，另一比色管中加入 1mL 三氯甲 烷，其它比色管分别加入 1mL 样品溶液及 1 滴乙酸酐，以下步骤同标准曲线的制备。 （三）计算 x=ρ/m×v×100/1000 式中：x－样品中维生素 A 含量，mg/100g（如按国际单位，1IU＝0.3ug 维生素 A）； ρ－由标准曲线上查得维生素 A 的含量，ug/mL； m－样品质量，g； v－抽取后加三氯甲烷定量的体积，mL； （四）讨论 1．本法摘自 GB12388－90，适用于食品中维生素 A 的测定。 2．三氯化锑有腐蚀性，不能粘在手上，三氯化锑与水能生成白色沉淀，所以不能碰到 水。 3．三氯化锑与维生素 A 生成的蓝色物质很不稳定，要在 6s 内完成吸光度的测定，否 则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低。 三、胡萝卜素的测定 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总 称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β－紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转移为 维生素 A，故称为维生素 A 原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β－胡萝卜素效价最高，β－胡 萝卜素的结构如下：
个cH 胡萝卜素主要存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素为食物的家贪、兽类、水产动物 的体内也会含有胡萝卜素。 胡萝人素对热、酸、碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝人 素可溶于脂肪及大多数有机溶剂，纯品为深红色带有金属光泽的晶体，其溶液在450m波 长处有最大吸收（正己烷），故只要能完全分离，便可定性定量。分离的方法常有纸层析 柱层析和高效液相色谱法等。国家标准GB12389一90采用的是纸层析法。 (一)原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层 析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗 脱后于450nm波长下进行比色测定。 (二)定步骤 1.样品处理 对于含脂量不高的样品，如粮食、水果、蔬菜等，样品经磨粉或打成匀浆后，直接加入 丙酮一石油醚混合溶剂反复抽提，直至抽提液无色为止，然后用分液漏斗分离出溶剂相经浓 缩定容后供层析点样用。如果是含脂量较高的样品，如植物 、油籽油料等，则需在提取色 素前先经50%KO州乙醇溶液皂化处理，皂化液再用石油醚反复提取。皂化过程可破坏植物 细胞壁，使胡萝卜素释放完全，并且可破坏叶绿素，减少对胡萝素卜素的色素分离干扰。 2.浓缩与定深 提取液经洗涤分离后，溶剂相减压蒸发，最后用石油醚定容，备层析点样用。 8. 展开与洗脱 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全 分开后，取出滤纸，自然挥发干石油酰，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测 定。 4.比色与含量计算 国标法采用1cm比色杯，于450m波长下吸光府从标准曲线上查出一湖萝人素含 量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以B一胡萝卜素计）。 (三)讨论 1.植物性样品中，胡萝卜素常与黄酮类物质、叶绿素等有色物质共存，黄桐类物质极 性稍大。叶绿素易在强碱性溶液中被降解。采用适当的分离方法可使胡萝卜素同其他干扰物 质分离。 2.皂化处理可提高胡萝卜素由细胞壁中的释放，并且减少提取时出现的乳化现象而带 来的误差。但皂化过程中的热处理会导致异构化反应的出现，反式结构的类胡萝卜素可能均 转化为顺式结构。 3.纸层析法、柱层析法均不能区分α一、B一和y一胡萝卜素，虽然标准品为那一胡萝卜 素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为B一胡萝卜素，故对结果影响不大。 4.用HPLC法可以获得更好的结果，其样品前处理与纸层析法基本相同，该法可以区 分α一、B一胡萝卜素，是一种目前先进的测定方法 四、维生素D的测定 维生素D是指含有抗狗偻病活性的一类物质，又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生 物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，具有维生素D活性的 6
6 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H3C CH3 胡萝卜素主要存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素为食物的家禽、兽类、水产动物 的体内也会含有胡萝卜素。 胡萝卜素对热、酸、碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜 素可溶于脂肪及大多数有机溶剂，纯品为深红色带有金属光泽的晶体，其溶液在 450nm 波 长处有最大吸收（正己烷），故只要能完全分离，便可定性定量。分离的方法常有纸层析、 柱层析和高效液相色谱法等。国家标准 GB12389－90 采用的是纸层析法。 （一）原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层 析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗 脱后于 450nm 波长下进行比色测定。 （二）测定步骤 1．样品处理 对于含脂量不高的样品，如粮食、水果、蔬菜等，样品经磨粉或打成匀浆后，直接加入 丙酮－石油醚混合溶剂反复抽提，直至抽提液无色为止，然后用分液漏斗分离出溶剂相经浓 缩定容后供层析点样用。如果是含脂量较高的样品，如植物油、油籽油料等，则需在提取色 素前先经 50％KOH 乙醇溶液皂化处理，皂化液再用石油醚反复提取。皂化过程可破坏植物 细胞壁，使胡萝卜素释放完全，并且可破坏叶绿素，减少对胡萝素卜素的色素分离干扰。 2．浓缩与定容 提取液经洗涤分离后，溶剂相减压蒸发，最后用石油醚定容，备层析点样用。 3．展开与洗脱 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全 分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测 定。 4．比色与含量计算 国标法采用 1cm 比色杯，于 450nm 波长下测吸光度，从标准曲线上查出－胡萝卜素含 量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以β－胡萝卜素计）。 （三）讨论 1．植物性样品中，胡萝卜素常与黄酮类物质、叶绿素等有色物质共存，黄酮类物质极 性稍大。叶绿素易在强碱性溶液中被降解。采用适当的分离方法可使胡萝卜素同其他干扰物 质分离。 2．皂化处理可提高胡萝卜素由细胞壁中的释放，并且减少提取时出现的乳化现象而带 来的误差。但皂化过程中的热处理会导致异构化反应的出现，反式结构的类胡萝卜素可能均 转化为顺式结构。 3．纸层析法、柱层析法均不能区分α－、β－和γ－胡萝卜素，虽然标准品为β－胡萝卜 素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为β－胡萝卜素，故对结果影响不大。 4．用 HPLC 法可以获得更好的结果，其样品前处理与纸层析法基本相同，该法可以区 分α－、β－胡萝卜素，是一种目前先进的测定方法。 四、维生素 D 的测定 维生素 D 是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生 物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，具有维生素 D 活性的
化合物钓有10种，记作维生素D2、D3、D,等，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其 雏生素D原。维生素D,无天然存在，维生素D,只存在于某些动物性食品中。但它们都可 由维生素D原（麦角固醇和7一脱氢胆固醇）经紫外线照射形成 麦角固醇 维生素D,(麦角钙化醇) 7一脱氢胆固 维生素D,(胆钙化醇 维生素D的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等 比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。高效液相色谱法是目前分析维生素D的最好 方法，灵敏度高，分析速度快，是我国国标GB/T5413.9一1997所采用的方法。这里仅介绍 高效液相色谱法 一)原理 试样在焦性没食子酸保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富 集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量。 (二)测定步骤 1.样品处理 样品溶液中加入2%焦性没食子酸乙醇溶液混匀后 再加入75%KO州溶液加热回流皂 化30min,冷却后转移入分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取液浓缩，最后用1mL正己 烷溶解备用。 2.正相硅胶柱富集 推荐HPLC条件 色谱柱：4mm×30cn ,硅胶柱。 流动相：正己烷与 环已烷按体积比1：1混合，并按体积分数08%加入异丙醇。 流速：1mmin,柱温：20C,检测波长：265nm。 注射50uL维生素D标样(1ugmL)和200uL样品溶液，根据维生素D标样保留时间 收集样品于试管中，将试管用氨气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解，供检测用。 3。反相C,。柱拾测 推荐HPLC条件 色谱柱：4.6mm×25cmC1s或同等性能色谱柱。 流动相：甲醇，流速：1mL/min,柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射50uL维生素D标准溶液和50uL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面 积或峰高。根据蜂面积（或峰高）的比值求算出样品中维生素D的含量。 (三)过论 1.本法摘自GB/T4139 1997，婴幼儿配方食品和乳粉通用检测方法中维生素D的测 定，适用于食品或强化食品及饲料中维生素D含量的测定。木法对维生素D2和D不加区 别，两者混合存在时，以总维生素D定量之。 7
7 化合物约有 10 种，记作维生素 D2、D3、D4 等，其中最重要的是维生素 D2、维生素 D3 及其 维生素 D 原。维生素 D2 无天然存在，维生素 D3 只存在于某些动物性食品中。但它们都可 由维生素 D 原（麦角固醇和 7－脱氢胆固醇）经紫外线照射形成： H3 C CH3 CH3 CH3 CH3 H CH3 HO CH2 H HO H CH3 H3C CH3 CH3 CH3 麦角固醇 维生素 D2(麦角钙化醇) H3C C H3 C H3 H O H3C H3C 7－脱氢胆固醇 维生素 D3(胆钙化醇) 维生素 D 的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等。 比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。高效液相色谱法是目前分析维生素 D 的最好 方法，灵敏度高，分析速度快，是我国国标 GB/T5413.9－1997 所采用的方法。这里仅介绍 高效液相色谱法。 （一）原理 试样在焦性没食子酸保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富 集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量。 （二）测定步骤 1．样品处理 样品溶液中加入 2％焦性没食子酸乙醇溶液混匀后，再加入 75％KOH 溶液加热回流皂 化 30min，冷却后转移入分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取液浓缩，最后用 1mL 正己 烷溶解备用。 2．正相硅胶柱富集 推荐 HPLC 条件。 色谱柱：4mm×30cm，硅胶柱。 流动相：正己烷与环己烷按体积比 1：1 混合，并按体积分数 0.8％加入异丙醇。 流速：1mL/min，柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射 50uL 维生素 D 标样（1ug/mL）和 200uL 样品溶液，根据维生素 D 标样保留时间 收集样品于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入 0.2mL 甲醇溶解，供检测用。 3．反相 C18柱检测 推荐 HPLC 条件 色谱柱：4.6mm×25cm C18 或同等性能色谱柱。 流动相：甲醇，流速：1mL/min，柱温：20℃，检测波长：265nm。 注射 50uL 维生素 D 标准溶液和 50uL 样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素 D 峰面 积或峰高。根据峰面积（或峰高）的比值求算出样品中维生素 D 的含量。 （三）讨论 1．本法摘自 GB/T5413.9－1997，婴幼儿配方食品和乳粉通用检测方法中维生素 D 的测 定，适用于食品或强化食品及饲料中维生素 D 含量的测定。本法对维生素 D2 和 D3 不加区 别，两者混合存在时，以总维生素 D 定量之。 H3C C H3 CH3 H O C H3 C H3
2.据资料介绍【杨祖英，食品检验，化学工业出版社，P53】样品用脂肪酶水解处理 用丙酮萃取，丙酮萃取液用乙醚再萃取，最后用HPLC定量测定，在265m下测维生素D 维生素K,在波长290nm 下测维生素A,维生素E。流动相为甲醇，C1s柱。 可同时测定四 种维生素含量。 3.维生素D含量的表示可用质量含量mg100g,也可用国际单位，1国际单位(1U) 相当于0.025ug维生素D。 第三节水溶性维生素的测定 水溶性维生素包括维生素B(硫胺素、维生素B,(核黄素)、维生素B。(吡哆醇、吡哆 醛、吡哆胺入、维生素PP(烟酸)、叶酸、泛酸（维生素B;入生物素（维生素B,)、维生素 C等，广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多 余的量都能从机体排出。 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯，乙酰 、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中 很稳定，即使加热也不破坏：但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。 它们易受空气、光、热、酵、金属离子等的影响。维生素B对光，特别是紫外线敏感，易 被光线破坏：维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 根据上术性质，测定水溶性维生素时，一船多在酸性溶湾中讲行前处理。雄生素B, B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶 木瓜蛋白酶等酶 作用。 使结合态维生 游离出来 再进行提取。为进一步去除杂质，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。雏生 素C通常用草酸、草酸一 乙醇、偏磷酸 一乙醇溶液直接提取。维生素C既具有有机酸 的性质，也具有还原剂的性质。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用：偏 磷酸本身不稳定，与水结合逐断变成磷酸.只能保存门、10天，且价格较贵，溶解费时，但 测定水溶性维 、维生素B,的测定 维生素B,又称抗神经炎素，它是由一个嘧啶环和一个摩唑环所组成的化合物，因其分 子中既含有氨(N),又含有硫(S),故又称硫胺素。硫胶素常以盐酸盐的形式出现，为白 鱼结品，溶于水，微溶于乙醇，不易被氧化，比较耐热，特别是在酸性介质中相当稳定。但 在碱性介质中对热极不稳定。亚硫酸盐在中、碱性介质中能加速硫胺素的分 和破坏。硫胺 素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧 光比色法定量。硫胺素能与多种重氨盐偶合呈现各种不同颜色，借此可用比色法测定。比色 法灵敏度较低，准确度也稍差，适用于含硫胺素高的样品。荧光法和高效液相色谱法灵敏度 很高，是目前常用的方法。 一)茨光比色法 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（此哆色素），在紫外光照射下，硫色素 发出蓝色荧光，在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，其荧光强度与硫色素的含 量成正比，反应式如下： CH H.C HC 硫胺素 硫色素
8 2．据资料介绍【杨祖英，食品检验，化学工业出版社，P.53】样品用脂肪酶水解处理， 用丙酮萃取，丙酮萃取液用乙醚再萃取，最后用 HPLC 定量测定，在 265nm 下测维生素 D， 维生素 K，在波长 290nm 下测维生素 A，维生素 E。流动相为甲醇，C18 柱。可同时测定四 种维生素含量。 3．维生素 D 含量的表示可用质量含量 mg/100g，也可用国际单位，1 国际单位（1IU） 相当于 0.025ug 维生素 D。 第三节 水溶性维生素的测定 水溶性维生素包括维生素 B1(硫胺素)、维生素 B2（核黄素）、维生素 B6（吡哆醇、吡哆 醛、吡哆胺）、维生素 PP（烟酸）、叶酸、泛酸（维生素 B3）、生物素（维生素 B7）、维生素 C 等，广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多 余的量都能从机体排出。 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中 很稳定，即使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。 它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。维生素 B2 对光，特别是紫外线敏感，易 被光线破坏；维生素 C 对氧、铜离子敏感，易被氧化。 根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般多在酸性溶液中进行前处理。维生素 B1、 B2 通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来， 再进行提取。为进一步去除杂质，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。维生 素 C 通常用草酸、草酸——乙醇、偏磷酸——乙醇溶液直接提取。维生素 C 既具有有机酸 的性质，也具有还原剂的性质。草酸价廉，使用方便，对维生素 C 有很好的稳定作用；偏 磷酸本身不稳定，与水结合逐渐变成磷酸，只能保存 7~10 天，且价格较贵，溶解费时，但 它能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量高的样品。 测定水溶性维生素的方法常有高效液相色谱法、荧光比色法、比色法和微生物法等。 一、维生素 B1 的测定 维生素 B1 又称抗神经炎素，它是由一个嘧啶环和一个噻唑环所组成的化合物，因其分 子中既含有氮（N），又含有硫（S），故又称硫胺素。硫胺素常以盐酸盐的形式出现，为白 色结晶，溶于水，微溶于乙醇，不易被氧化，比较耐热，特别是在酸性介质中相当稳定。但 在碱性介质中对热极不稳定。亚硫酸盐在中、碱性介质中能加速硫胺素的分解和破坏。硫胺 素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧 光比色法定量。硫胺素能与多种重氮盐偶合呈现各种不同颜色，借此可用比色法测定。比色 法灵敏度较低，准确度也稍差，适用于含硫胺素高的样品。荧光法和高效液相色谱法灵敏度 很高，是目前常用的方法。 (一)荧光比色法 1．原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（吡哆色素），在紫外光照射下，硫色素 发出蓝色荧光，在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，其荧光强度与硫色素的含 量成正比，反应式如下： S N NH2 N H3C N CH3 CH2CH2OH Cl S N H3C N CH3 N CH2CH2OH N 硫胺素 硫色素
如样品中所含杂质较多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后测定纯化 液中硫胺素的含量。 2.样品处理步骤 ()提取 称取一定量试样，加0.3molL盐酸溶液使其溶解后置103Kpa压力锅中水解，冷却后中 和至PH4.5,再加淀粉酶水解，使硫胺素游离出来。 ))净化 吸取提取液2080mL留于己特好活性人造弗石的盐基交换营中，使被胺素被话性沸石 吸附，然后用热的酸性氯化钾溶液洗脱，收集洗脱液定容后待测定，同时作标准硫胺素应用 液的吸附和洗脱对照。 (3)氧化 取A、B两个Maizel一Gerson反应瓶，各加5mL试样净化液，A瓶中节3mLl5g/100ml 氢氧化钠溶液（试剂空白），B瓶中加3mL碱性铁氰化钾溶液（试样），于相同条件下振摇， 各加10mL正丁醇萃取。以同样步骤作标准硫胺素应用液的氧化和萃取。分离出萃取液后供 测荧光强度 3.荧光强度测定 在激发波长365nm.狭缝5nm:发射波长435nm.狭缝5nm条件下依次测定试样空白、 标准空白、试样、标样的荧光强度。 4结果计算 x=U-U×(p×V)S-S)XV,W2×1m×100/1000 式中：x一样品中硫胺素含量，mg/100g: 一试样荧光强度： U。一试样空白荧光强度： -硫胺素标准应用液浓度，gmL: V一用于净化的硫胺素标准应用液体积，L V,一试样水解后定容的体积，L: V,一试样用于净化的提取液体积，ml: m一样品重量，g 100/10 一样品含量由ug换算成mg100g的系数 5.讨论 ①本法摘自GB12390-90,适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附疏胺素 能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品。 ②硫色素在紫外线照射下会被破坏，故硫胺素氧化后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室 中进行氧化和荧光测 ③操作过程中的其它注意事项，详见GB12390-90中的说明。 (二)高效液相色谱法同时测定食品中B族维生素(B1、B、B5、叶酸》 1。顶理 高效液相色普法用于测定B族维生素是近年来报消最多的新方法，它具有操作简便 准确可靠的特点。由于普及上的原因，暂未被我国国标所采用。本法以庚烷磺酸的甲醇溶液 为流动相，用紫外和荧光检测器以标准对照法定量测定。 2.样品处理 样品处理方法参照荧光法中样品处理步骤，在酸性介质中加压水解，水解液先用滤纸 9
9 如样品中所含杂质较多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后测定纯化 液中硫胺素的含量。 2．样品处理步骤 (1) 提取 称取一定量试样，加 0.3mol/L 盐酸溶液使其溶解后置 103Kpa 压力锅中水解，冷却后中 和至 PH4.5，再加淀粉酶水解，使硫胺素游离出来。 (2) 净化 吸取提取液 20~80mL 置于已装好活性人造沸石的盐基交换管中，使硫胺素被活性沸石 吸附，然后用热的酸性氯化钾溶液洗脱，收集洗脱液定容后待测定，同时作标准硫胺素应用 液的吸附和洗脱对照。 (3) 氧化 取 A、B 两个 Maizel—Gerson 反应瓶，各加 5mL 试样净化液，A 瓶中节 3mL15g/100mL 氢氧化钠溶液（试剂空白），B 瓶中加 3mL 碱性铁氰化钾溶液（试样），于相同条件下振摇， 各加 10mL 正丁醇萃取。以同样步骤作标准硫胺素应用液的氧化和萃取。分离出萃取液后供 测荧光强度。 3．荧光强度测定 在激发波长 365nm，狭缝 5nm；发射波长 435nm，狭缝 5nm 条件下依次测定试样空白、 标准空白、试样、标样的荧光强度。 4．结果计算 x=(U－Ub)×（p×V）/(S－Sb)×V1/V2×1/m×100/1000 式中：x—样品中硫胺素含量，mg/100g； U—试样荧光强度； Ub—试样空白荧光强度； S—标准荧光强度； Sb—标准空白荧光强度； ρ—硫胺素标准应用液浓度，ug/mL； V—用于净化的硫胺素标准应用液体积，mL； V1—试样水解后定容的体积，mL； V2—试样用于净化的提取液体积，mL； m—样品重量，g； 100/1000—样品含量由 ug/g 换算成 mg/100g 的系数。 5．讨论 ①本法摘自 GB12390-90，适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素 能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品。 ②硫色素在紫外线照射下会被破坏，故硫胺素氧化后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室 中进行氧化和荧光测定。 ③操作过程中的其它注意事项，详见 GB12390-90 中的说明。 (二) 高效液相色谱法同时测定食品中 B 族维生素（B1、B2、B5、叶酸） 1．原理 高效液相色谱法用于测定 B 族维生素是近年来报道最多的新方法，它具有操作简便、 准确可靠的特点。由于普及上的原因，暂未被我国国标所采用。本法以庚烷磺酸的甲醇溶液 为流动相，用紫外和荧光检测器以标准对照法定量测定。 2．样品处理 样品处理方法参照荧光法中样品处理步骤，在酸性介质中加压水解，水解液先用滤纸
粗滤，使用前再用0.45mm微孔过滤膜过滤备用。 3。液相色善参老条件 (1)高效液相色谱仪 具紫外检测器和荧光检测器 (②)色谱柱 (3)流动相 30%甲醇70%重蒸水加入0.005mol/L庚烷磺酸离子对试剂(PIC一B,), 使PH值保持在PH5左右。 (4)流速1.0 mL/min (5)拾器 紫外254nm,荧光5，-290nm,5M395nm (6)灵敏度 紫外0.16ATT,荧光0.08AT (7)柱温 室温 (8)讲样量 标准、样品均为20L。 4.结果计算 x=h/hox。 x100/m×100 式中：x一样品中维生素含量，g100g h一样品峰高 ho一标准峰高 p一标准溶液维生素浓度，ugmL: 一样品质量，g 讨论 ()本法摘自《食品检验》（主编杨祖英，化学工业出版社，2001年）P59-61。 (2)改变样品处理方法以及色谱条件，还可同时测定维生素B1、B6、烟酸、烟酰胺等。 参考资料同上书P57-59。 、维生素B,的测定 维生素B又名核黄素 是由核醇与异略嗪连接而成的化合物。能溶于水， 水溶液呈 现强的黄绿色荧光，对空气 热稳定，在中性和酸性溶液，即使短时间高压加热 破坏，在120℃下加热6，仅有少量破坏，但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光 敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。在碱性溶液中受光线照射很快转化为光黄素，有 较强的荧光强度。 测定核蕾素常用的方法有荧光法和高效液相鱼进法。光法又分为测定自身光的核 素荧光法和测定光分解产物荧光的光黄素荧光法 前者分析精度不高 只适合于测定比较 纯的试样，后者的灵敏度、精密度都较高，且只要提取完全，可省去将结合型核黄素转变 游离型的操作。高效液相色谱法具有简便、快速的特点。我国国标GB12391-90中采用的是 核黄素荧光法。 ()百理 核黄素在440-500m m波长光照射下产生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素含 量成正比。先把样品中的核黄素经硅镁吸附剂吸附分离，除去干扰杂质后测定其荧光强度 然后在试液中加入低亚硫酸钠(NSOB2,也叫连二亚硫酸钠)，将核黄素还原为无荧光的 物质，再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，还原前后的差值即为食品中核黄素所产生的 强度。 H.C 0 核黄素 无色核黄素
10 粗滤，使用前再用 0.45mm 微孔过滤膜过滤备用。 3．液相色谱参考条件 ⑴高效液相色谱仪 具紫外检测器和荧光检测器 ⑵色谱柱 uBONDAPAKTMC183·9 ⑶流动相 30%甲醇 70%重蒸水加入 0.005mol/L 庚烷磺酸离子对试剂（PIC—B7）， 使 PH 值保持在 PH5 左右。 ⑷流速 1.0mL/min ⑸检测器 紫外 254nm，荧光ξx=290nm，ξM=395nm ⑹灵敏度 紫外 0.16ATT，荧光 0.08ATT ⑺柱温 室温 ⑻进样量 标准、样品均为 20uL。 4．结果计算 x=h/h0×ρ×100/m×100 式中：x—样品中维生素含量，ug/100g； h—样品峰高； h0—标准峰高； ρ—标准溶液维生素浓度，ug/ mL； m—样品质量，g。 5．讨论 ⑴本法摘自《食品检验》（主编杨祖英，化学工业出版社，2001 年）P.59~61。 ⑵改变样品处理方法以及色谱条件，还可同时测定维生素 B1、B6、烟酸、烟酰胺等。 参考资料同上书 P.57~59。 二、维生素 B2 的测定 维生素 B2 又名核黄素，是由核糖醇与异咯嗪连接而成的化合物。能溶于水，水溶液呈 现强的黄绿色荧光，对空气、热稳定，在中性和酸性溶液，即使短时间高压加热，亦不致于 破坏，在 120℃下加热 6h，仅有少量破坏，但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光 敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。在碱性溶液中受光线照射很快转化为光黄素，有 较强的荧光强度。 测定核黄素常用的方法有荧光法和高效液相色谱法。荧光法又分为测定自身荧光的核黄 素荧光法和测定光分解产物荧光的光黄素荧光法 ，前者分析精度不高，只适合于测定比较 纯的试样，后者的灵敏度、精密度都较高，且只要提取完全，可省去将结合型核黄素转变为 游离型的操作。高效液相色谱法具有简便、快速的特点。我国国标 GB 12391-90 中采用的是 核黄素荧光法。 ㈠ 原理 核黄素在 440~500nm 波长光照射下产生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素含 量成正比。先把样品中的核黄素经硅镁吸附剂吸附分离，除去干扰杂质后测定其荧光强度， 然后在试液中加入低亚硫酸钠（Na2S2O B2，也叫连二亚硫酸钠），将核黄素还原为无荧光的 物质，再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，还原前后的差值即为食品中核黄素所产生的 强度。 N N N H H 3 C N H 3 C H 2 C O O C H C H C H C H 2 O H O H O H O H N H O H3C O H3C N CH2-(CHOH)3-CH2OH NH 核黄素 无色核黄素