52 食品安全与卫生检测 实训教学指导书 （食品加工技术专业、食品安全监测专业） 吉林粮食高等专科学校 2004 年 6 月
52 食品安全与卫生检测 实训教学指导书 （食品加工技术专业、食品安全监测专业） 吉林粮食高等专科学校 2004 年 6 月
53 《食品安全与卫生检测》实训指导书 依据《食品安全与卫生检测》课程教学大纲的要求，结合我校的实际情况， 编写本指导书，作这《食品安全与卫生检测》任课教师教学参考和食品工程专 业教学用书。全书共分 10 个实训专题，建议教学学时为 30～50 学时。 《食品安全与卫生检测》是在学过分析化学、食品生物化学、食品微生物 学等课程的基础上开设的，与《食品营养与检测》构成了一个既相互联系、又 相对独立的有机整体，是高职高专院校食品加工技术专业一门技术性、实践性 很强的专业基础课程，是能够把基础课与专业课紧密联结起来的一门应用科学。 该课程主要讲授食品的安全卫生、食品卫生检测有关知识、食品卫生检测技术、 食品安全管理、食品卫生监督、国家食品卫生法与世界卫生组织、典型食品安 全卫生案例分析等。 通过本课程各教学环节，要求学生掌握从事食品生产与加工、食品营销及 检测等职业岗位群工作所必须具备的基本知识、基本原理和基本技能；能合理 运用所学知识和技能，提高食品品质，保证食品的安全性。使学生在食品加工 实践中具备发现问题、分析问题和解决问题的能力；了解国内外食品安全与检 测的科学技术动向。 因此，本课程承担着培养食品专业高级实用型专门人才和提高食品安全、 卫生检测技术的双重任务。 在具体实施中，既可以采取理论与实训结合的教学形式，也可单独组织实 训教学。要强调所有实际操作必须符合食品行业卫生规范、职场卫生健康、操 作规程等的要求。要强调紧密结合生产实践，改革实验教学内容，减少演示性、 验证性实验，增加工艺性、设计性、综合性实验，逐步形成基本实践能力与操 作技能、综合实践能力与综合技能有机结合的实践教学体系。构建具有高职高 专食品专业特色的“实验、认识实习、生产实习、专业综合训练、毕业实习” 的实践教学模式。 吉林粮食高等专科学校 食品科学与工程系 2004 年 6 月
53 《食品安全与卫生检测》实训指导书 依据《食品安全与卫生检测》课程教学大纲的要求，结合我校的实际情况， 编写本指导书，作这《食品安全与卫生检测》任课教师教学参考和食品工程专 业教学用书。全书共分 10 个实训专题，建议教学学时为 30～50 学时。 《食品安全与卫生检测》是在学过分析化学、食品生物化学、食品微生物 学等课程的基础上开设的，与《食品营养与检测》构成了一个既相互联系、又 相对独立的有机整体，是高职高专院校食品加工技术专业一门技术性、实践性 很强的专业基础课程，是能够把基础课与专业课紧密联结起来的一门应用科学。 该课程主要讲授食品的安全卫生、食品卫生检测有关知识、食品卫生检测技术、 食品安全管理、食品卫生监督、国家食品卫生法与世界卫生组织、典型食品安 全卫生案例分析等。 通过本课程各教学环节，要求学生掌握从事食品生产与加工、食品营销及 检测等职业岗位群工作所必须具备的基本知识、基本原理和基本技能；能合理 运用所学知识和技能，提高食品品质，保证食品的安全性。使学生在食品加工 实践中具备发现问题、分析问题和解决问题的能力；了解国内外食品安全与检 测的科学技术动向。 因此，本课程承担着培养食品专业高级实用型专门人才和提高食品安全、 卫生检测技术的双重任务。 在具体实施中，既可以采取理论与实训结合的教学形式，也可单独组织实 训教学。要强调所有实际操作必须符合食品行业卫生规范、职场卫生健康、操 作规程等的要求。要强调紧密结合生产实践，改革实验教学内容，减少演示性、 验证性实验，增加工艺性、设计性、综合性实验，逐步形成基本实践能力与操 作技能、综合实践能力与综合技能有机结合的实践教学体系。构建具有高职高 专食品专业特色的“实验、认识实习、生产实习、专业综合训练、毕业实习” 的实践教学模式。 吉林粮食高等专科学校 食品科学与工程系 2004 年 6 月
54 实训一 花生中黄曲霉毒素 B1的检测 一、目的 1、熟练掌握薄层层析法原理。 2、掌握薄层层析操作作方法。 二、原理 样品中黄曲霉毒素 B1经有机溶剂提取，浓缩、净化以及薄层分离前处理后， 在波长 365nm 紫外光下产生兰紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检 出量来测定含量。 三、试剂 1．三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮 2．正己烷（沸程 30～60℃）或石油醚（沸程 60～90℃）. 3．无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水 4．苯――乙腈（98：2）混合溶液：量取 98ml 苯，加 2ml 乙腈，混匀。 5．甲醇――水（55：45）溶液：配制方法同上。 6．三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠 7．硅胶 G，薄层色谱用。 8．AFTB1 标准溶液的制备：用百万分之一的微量分析天平精密称取 1～ 1.2mgAFTB1标准品，先加入 2ml 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100ml。然后避光 置于 4℃冰箱中保存。最后进行 AFTB1标准溶液浓度的测定。（此标准溶液浓度 为 10μg/ml）。 9．AFTB1标准使用液Ⅰ：精密吸取 1ml10μg/ml 标准溶液于 10ml 容量瓶中， 加苯－乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液浓度为 1μg/ml。 10．AFTB1标准使用液Ⅱ：精密吸取 1.0ml1μg/mlAFTB1标准使用液Ⅰ于 5ml 容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.2μg/ml。 11．AFTB1标准使用液Ⅲ：精密吸取 1.0mlAFTB1标准使用液Ⅱ于 5ml 容量瓶 中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.04μg/ml。 12．50/L 次氯酸钠溶液：取 100g 漂白精，加入 500ml 水，搅拌均匀。另将 160g 工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于 500ml 温水中，再将两液混合，搅拌， 澄清后，再过滤即可。 四、仪器和用具 1．小型粉碎机、样筛、电动振荡器 2．全玻璃浓缩器、电子恒温水浴锅、薄层板涂布器 3．玻璃板：5cm×20cm。 4．展开槽：内长 25cm，宽 6cm，高 4cm。 5．紫外光灯：100～125W，带有波长 365nm 滤光片 6．微量进样器、蒸发器：50ml 五、操作步骤 1．样品提取、净化
54 实训一 花生中黄曲霉毒素 B1的检测 一、目的 1、熟练掌握薄层层析法原理。 2、掌握薄层层析操作作方法。 二、原理 样品中黄曲霉毒素 B1经有机溶剂提取，浓缩、净化以及薄层分离前处理后， 在波长 365nm 紫外光下产生兰紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检 出量来测定含量。 三、试剂 1．三氯甲烷、甲醇、苯、乙腈、丙酮 2．正己烷（沸程 30～60℃）或石油醚（沸程 60～90℃）. 3．无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水 4．苯――乙腈（98：2）混合溶液：量取 98ml 苯，加 2ml 乙腈，混匀。 5．甲醇――水（55：45）溶液：配制方法同上。 6．三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠 7．硅胶 G，薄层色谱用。 8．AFTB1 标准溶液的制备：用百万分之一的微量分析天平精密称取 1～ 1.2mgAFTB1标准品，先加入 2ml 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100ml。然后避光 置于 4℃冰箱中保存。最后进行 AFTB1标准溶液浓度的测定。（此标准溶液浓度 为 10μg/ml）。 9．AFTB1标准使用液Ⅰ：精密吸取 1ml10μg/ml 标准溶液于 10ml 容量瓶中， 加苯－乙腈混合液至刻度，混匀。此溶液浓度为 1μg/ml。 10．AFTB1标准使用液Ⅱ：精密吸取 1.0ml1μg/mlAFTB1标准使用液Ⅰ于 5ml 容量瓶中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.2μg/ml。 11．AFTB1标准使用液Ⅲ：精密吸取 1.0mlAFTB1标准使用液Ⅱ于 5ml 容量瓶 中，加苯－乙腈混合液稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0.04μg/ml。 12．50/L 次氯酸钠溶液：取 100g 漂白精，加入 500ml 水，搅拌均匀。另将 160g 工业用碳酸钠（Na2CO3·10H2O）溶于 500ml 温水中，再将两液混合，搅拌， 澄清后，再过滤即可。 四、仪器和用具 1．小型粉碎机、样筛、电动振荡器 2．全玻璃浓缩器、电子恒温水浴锅、薄层板涂布器 3．玻璃板：5cm×20cm。 4．展开槽：内长 25cm，宽 6cm，高 4cm。 5．紫外光灯：100～125W，带有波长 365nm 滤光片 6．微量进样器、蒸发器：50ml 五、操作步骤 1．样品提取、净化
55 样品去壳去皮粉碎后，称取 20g 粉碎过筛样品，置于 250ml 具塞锥形瓶中， 加 30ml 正乙烷或石油醚和 100ml 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。 振荡 30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等 下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中。取 20.0ml 甲醇 水溶液提取液（相当于 4g 样品）置于另一个 125ml 分液漏斗中，加 20mlCHCl3， 振摇 2min，静置分层（如出现乳化则可滴加甲醇使其分层），放出 CHCl3层，经 盛有约10g先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50ml蒸发皿中， 分液漏斗中再加 5mlCHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少 量 CHCl3洗滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于 65℃水浴上通 风挥干，然后放在冰箱内冰却 2－3min 后，准确加入 1ml 苯－乙腈混合液（或 将 CHCl3用浓缩蒸馏器减压吹干蒸干，然后再准确加入 1ml 苯－乙腈混合液）。 用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，如果有苯的结晶析出，则将蒸发皿 取下，继续溶解、混合，晶体则立即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2ml 具塞试管中。 2．样品的测定（单向展开法） （1）薄层板的制备：称取约 3g 硅胶 G，加入相当于硅胶量 2－3 倍左右的 水，用力研磨 1－2min 至成糊状后立即倒入涂布器内，推成 5×20cm，厚度约 0.25mm 的簿层板三块。在空气中干燥大约 15min 后，放入 100℃烘箱内活化 2h， 取出在干燥器中保存。一般可保存 2－3d，若放置时间较长，可再进行干燥活 化后使用。 （2）点样：将簿层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 处做一 个基线，然后在基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边 缘和点间距约为 1cm，点直径约为 3mm。要求在同一块板上滴加点的大小应一致， 可用吹风机冷风边吹边加。滴加的样点如下： 第一点：10μl、0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样品溶液。 第三点：20μl 样液＋10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液＋10μl 0.2μg/mlAFTB1标准使用液。 （3）展开与观察：加入 10ml 无水乙醚于展开槽内，预展 12cm，取出挥干。 再于另一展开槽内加入 10ml 丙酮：三氯甲烷（8：92）溶剂，展开 10－12cm， 取出在紫外光下观察结果，方法如下： ①第一点滴加 10μlAFTB1标准使用液，其中含 AFTB10.04μg/ml（最低检出 量 5μg/kg）。可作为检验薄层板好坏及色谱是否合适，能检出最低检出量。如果 展开后此点无荧光，则说明薄层板或色谱条件存在问题。 ②第三点和第四点上滴加了样液和 AFTB1标准液，可使样液中的 AFTB1荧光 点和标液 AFTB1荧光点重叠。加以认证。 第三点是用来检验最低检出量在样液中是否能正常呈现，如果第一点呈阳 性，第三点呈阴性则说明样品的提取存在问题，可能存在荧光猝灭剂，应重新
55 样品去壳去皮粉碎后，称取 20g 粉碎过筛样品，置于 250ml 具塞锥形瓶中， 加 30ml 正乙烷或石油醚和 100ml 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。 振荡 30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等 下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中。取 20.0ml 甲醇 水溶液提取液（相当于 4g 样品）置于另一个 125ml 分液漏斗中，加 20mlCHCl3， 振摇 2min，静置分层（如出现乳化则可滴加甲醇使其分层），放出 CHCl3层，经 盛有约10g先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50ml蒸发皿中， 分液漏斗中再加 5mlCHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少 量 CHCl3洗滤器，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风橱内于 65℃水浴上通 风挥干，然后放在冰箱内冰却 2－3min 后，准确加入 1ml 苯－乙腈混合液（或 将 CHCl3用浓缩蒸馏器减压吹干蒸干，然后再准确加入 1ml 苯－乙腈混合液）。 用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，如果有苯的结晶析出，则将蒸发皿 取下，继续溶解、混合，晶体则立即消失，再用此滴管吸取上清液转移于 2ml 具塞试管中。 2．样品的测定（单向展开法） （1）薄层板的制备：称取约 3g 硅胶 G，加入相当于硅胶量 2－3 倍左右的 水，用力研磨 1－2min 至成糊状后立即倒入涂布器内，推成 5×20cm，厚度约 0.25mm 的簿层板三块。在空气中干燥大约 15min 后，放入 100℃烘箱内活化 2h， 取出在干燥器中保存。一般可保存 2－3d，若放置时间较长，可再进行干燥活 化后使用。 （2）点样：将簿层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 处做一 个基线，然后在基线上用微量注射器滴加样液。一块板可滴加 4 个点，点距边 缘和点间距约为 1cm，点直径约为 3mm。要求在同一块板上滴加点的大小应一致， 可用吹风机冷风边吹边加。滴加的样点如下： 第一点：10μl、0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样品溶液。 第三点：20μl 样液＋10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液＋10μl 0.2μg/mlAFTB1标准使用液。 （3）展开与观察：加入 10ml 无水乙醚于展开槽内，预展 12cm，取出挥干。 再于另一展开槽内加入 10ml 丙酮：三氯甲烷（8：92）溶剂，展开 10－12cm， 取出在紫外光下观察结果，方法如下： ①第一点滴加 10μlAFTB1标准使用液，其中含 AFTB10.04μg/ml（最低检出 量 5μg/kg）。可作为检验薄层板好坏及色谱是否合适，能检出最低检出量。如果 展开后此点无荧光，则说明薄层板或色谱条件存在问题。 ②第三点和第四点上滴加了样液和 AFTB1标准液，可使样液中的 AFTB1荧光 点和标液 AFTB1荧光点重叠。加以认证。 第三点是用来检验最低检出量在样液中是否能正常呈现，如果第一点呈阳 性，第三点呈阴性则说明样品的提取存在问题，可能存在荧光猝灭剂，应重新
56 提取。 第四点主要是起定位作用。AFTB1的 Rf 值约 0.6。 ③第二点起判断作用。如果第二点（样液）在 AFTB1标准点的相应位置（Rf ≈0.6）处呈阴性，而其它各点均呈阳性，则说明样品中 AFBT1的含量在 5μg/kg （最低检出量）以下，如果第二点在其相应位置上呈阳性，则需进行确证试验。 （4）确证试验：为了证明在薄层板上样液呈现的荧光确系由 AFTB1产生的， 则在样点上滴加三氟乙酸，产生 AFTB1的衍生物，继续展开后，此衍生物的 Rf 值约为 0.1 左右。方法如下： 依次在薄层板左边滴加两个点： 第一点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样液。 在以上两点处各加一小滴三氟乙酸盖于其上，经反应 5min 后，用电吹风机 吹热风 2min，热风吹到薄层板上的温度不得高于 40℃，再于薄板右边滴加以下 两点。 第三点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液。 同前展开后，在紫外光下观察样液是否产生与 AFTB1标准点相同的衍生物。 第三点和第四点，可作为样液与标准衍生物的空白对照。 （5）稀释定量：样液中的 AFTB1荧光点的荧光强度与 AFTB1标准点（最低检 出量）的荧光强度一致，则表示样品 AFTB1 含量在 5μg/kg；如样液中荧光强 度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直 至样液点的荧光强调与最低检出量的荧光强度一致为止，滴加样式如下： 第一点：10μg/ml AFTB1标使液。 第二点：根据具体情况点 10μl 样液。 第三点：根据具体情况点 15μl 样液。 第四点：根据具体情况点 20μl 样液。 （6）计算： X=0.0004× V m V D 2 1 （3－1） 式中：X —— 样品中 AFTB1的含量，μg/kg； V1 —— 稀释前样液的体积，ml； V2 —— 出现同样最低荧光强度时滴加样液的点样量，μl； D —— 样液的总稀释倍数； m —— 稀释前相当样品的质量，g； 0.0004 —— AFTB1的最低检出量，μg。 注意事项 1．本法的灵敏度较高，容易产生误差。如薄层板制作不平整、不均匀，点
56 提取。 第四点主要是起定位作用。AFTB1的 Rf 值约 0.6。 ③第二点起判断作用。如果第二点（样液）在 AFTB1标准点的相应位置（Rf ≈0.6）处呈阴性，而其它各点均呈阳性，则说明样品中 AFBT1的含量在 5μg/kg （最低检出量）以下，如果第二点在其相应位置上呈阳性，则需进行确证试验。 （4）确证试验：为了证明在薄层板上样液呈现的荧光确系由 AFTB1产生的， 则在样点上滴加三氟乙酸，产生 AFTB1的衍生物，继续展开后，此衍生物的 Rf 值约为 0.1 左右。方法如下： 依次在薄层板左边滴加两个点： 第一点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第二点：20μl 样液。 在以上两点处各加一小滴三氟乙酸盖于其上，经反应 5min 后，用电吹风机 吹热风 2min，热风吹到薄层板上的温度不得高于 40℃，再于薄板右边滴加以下 两点。 第三点：10μl 0.04μg/mlAFTB1标准使用液。 第四点：20μl 样液。 同前展开后，在紫外光下观察样液是否产生与 AFTB1标准点相同的衍生物。 第三点和第四点，可作为样液与标准衍生物的空白对照。 （5）稀释定量：样液中的 AFTB1荧光点的荧光强度与 AFTB1标准点（最低检 出量）的荧光强度一致，则表示样品 AFTB1 含量在 5μg/kg；如样液中荧光强 度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样量或将样液稀释后再点样，直 至样液点的荧光强调与最低检出量的荧光强度一致为止，滴加样式如下： 第一点：10μg/ml AFTB1标使液。 第二点：根据具体情况点 10μl 样液。 第三点：根据具体情况点 15μl 样液。 第四点：根据具体情况点 20μl 样液。 （6）计算： X=0.0004× V m V D 2 1 （3－1） 式中：X —— 样品中 AFTB1的含量，μg/kg； V1 —— 稀释前样液的体积，ml； V2 —— 出现同样最低荧光强度时滴加样液的点样量，μl； D —— 样液的总稀释倍数； m —— 稀释前相当样品的质量，g； 0.0004 —— AFTB1的最低检出量，μg。 注意事项 1．本法的灵敏度较高，容易产生误差。如薄层板制作不平整、不均匀，点
57 样的间距太小等都会产生误差。 2．AFTB1 标准储备液应密封于具塞试管中，在 4 o c 冰箱中避光保存。如果 在保存期间体积明显减少，应及时补充溶剂。使用前，应对其测定标准液的浓 度。 3．AFT 是一种剧毒和强致癌性物质，因此，在使用时特别注意其安全保护。 如实验时应佩戴口罩，配标液时应戴乳胶手套。如被标液污染时应及时用 50g/L 次氯酸钠溶液浸泡消毒。实验结束后应做好清洗消毒工作，对于剩余的 AFT 标 液以及呈阳性样液，应先用 50g/L 次氯酸钠处理后方可倒在指定的地方。实验 所用玻璃器皿消毒后再进行清洗（用 50g/L次氯酸那浸泡 5min）。 实训二、食品中 N－亚硝胺化合物的检测 一、目的 1、熟练掌握食品中 N-亚硝胺化合物的测定原理。 2、掌握食品中 N-亚硝胺化合物的测定方法。 二、测定原理 本法是测定食品中挥发性 N－亚硝胺总量的方法。 食品中挥发性亚硝胺经水蒸气蒸馏纯化后，经过紫外光照射，分解释放为 亚硝酸根。然后利用强碱性离子交换树脂浓缩，在酸性条件下与对位氨基苯磺 酸形成重氮盐，最后与 N－萘乙烯二胺二盐酸盐形成红色偶氮染料。颜色的深 浅与 N－亚硝胺的含量成正比。 三、试剂 1．0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH7）：分别吸取 0.1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 61.9ml 和 0.1mol/L 磷酸氢二钠（NaH2PO4）39.0ml，将两者混合而成缓冲溶液。 2．300g/L 醋酸溶液 3．0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4．1.7mol/L 盐酸溶液 5．100μg/ml 二乙基亚硝胺标准溶液 6．100μg/ml 亚硝酸钠标准溶液 7．1mol/L 氢氧化钠溶液：用正丁醇饱和 8．10g/L 硫酸锌溶液 9．强碱性离子交换树脂：交链度 8，粒度 150 目。 10．显色剂： 显色剂 A――10g/L 对位氨基苯磺酸的 300g/L 醋酸溶液 显色剂 B――2g/LN－1－萘乙烯二胺二盐酸盐的 300g/L 醋酸溶液 显色剂 C――10g/L 对位氨基苯磺酸的 1.7mol/L 盐酸溶液 显色剂 D――10g/L N－1－萘乙烯二胺二盐酸盐溶液 四、仪器和用具 分光光度计、紫外灯：BR－69 盘形杀菌灯（10W）。 五、操作方法
57 样的间距太小等都会产生误差。 2．AFTB1 标准储备液应密封于具塞试管中，在 4 o c 冰箱中避光保存。如果 在保存期间体积明显减少，应及时补充溶剂。使用前，应对其测定标准液的浓 度。 3．AFT 是一种剧毒和强致癌性物质，因此，在使用时特别注意其安全保护。 如实验时应佩戴口罩，配标液时应戴乳胶手套。如被标液污染时应及时用 50g/L 次氯酸钠溶液浸泡消毒。实验结束后应做好清洗消毒工作，对于剩余的 AFT 标 液以及呈阳性样液，应先用 50g/L 次氯酸钠处理后方可倒在指定的地方。实验 所用玻璃器皿消毒后再进行清洗（用 50g/L次氯酸那浸泡 5min）。 实训二、食品中 N－亚硝胺化合物的检测 一、目的 1、熟练掌握食品中 N-亚硝胺化合物的测定原理。 2、掌握食品中 N-亚硝胺化合物的测定方法。 二、测定原理 本法是测定食品中挥发性 N－亚硝胺总量的方法。 食品中挥发性亚硝胺经水蒸气蒸馏纯化后，经过紫外光照射，分解释放为 亚硝酸根。然后利用强碱性离子交换树脂浓缩，在酸性条件下与对位氨基苯磺 酸形成重氮盐，最后与 N－萘乙烯二胺二盐酸盐形成红色偶氮染料。颜色的深 浅与 N－亚硝胺的含量成正比。 三、试剂 1．0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH7）：分别吸取 0.1mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 61.9ml 和 0.1mol/L 磷酸氢二钠（NaH2PO4）39.0ml，将两者混合而成缓冲溶液。 2．300g/L 醋酸溶液 3．0.5mol/L 氢氧化钠溶液 4．1.7mol/L 盐酸溶液 5．100μg/ml 二乙基亚硝胺标准溶液 6．100μg/ml 亚硝酸钠标准溶液 7．1mol/L 氢氧化钠溶液：用正丁醇饱和 8．10g/L 硫酸锌溶液 9．强碱性离子交换树脂：交链度 8，粒度 150 目。 10．显色剂： 显色剂 A――10g/L 对位氨基苯磺酸的 300g/L 醋酸溶液 显色剂 B――2g/LN－1－萘乙烯二胺二盐酸盐的 300g/L 醋酸溶液 显色剂 C――10g/L 对位氨基苯磺酸的 1.7mol/L 盐酸溶液 显色剂 D――10g/L N－1－萘乙烯二胺二盐酸盐溶液 四、仪器和用具 分光光度计、紫外灯：BR－69 盘形杀菌灯（10W）。 五、操作方法
58 1．亚硝胺标准曲线绘制 准确吸取亚硝胺标准溶液 0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10ml，分别放 入小培养皿中，在小培养皿中分别加入 PH7 的磷酸缓冲溶液，使溶液的总体积 为 2.0ml，摇匀。在紫外光下照 1min。然后依次加入 0.5ml 显色剂 A，摇匀， 再加入 0.5ml 显色剂 B，使溶液呈玫瑰红色后，分别在 550nm 波长下用分光光 度计测定其吸光度，然后绘制其标准曲线。 2．样品的制备 液体样品：称取 10.0－20.0g 样品（根据样品中亚硝胺的含量大小称量）， 移入 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/L 氢氧化钠溶液，调整其浓度为 1mol/L， 摇匀后过滤，收集滤液备用。 固体样品：将固体样品捣碎或研磨搅拌均匀，称取 20.0g，用正丁醇饱和过 的 1mol/L 氢氧化钠溶液将其转移入 100ml 容量瓶中至刻度，摇匀后浸泡过夜， 最后离心取清液备用。 3．挥发性 N－亚硝胺总量的测定 吸取样品 50ml 清液置于蒸馏瓶内，将其进行夹层保温水蒸气蒸馏，收集馏 出液 25ml，用 300g/L 醋酸溶液调节其 PH 值至 3－4。再继续蒸馏，再收集馏出 液 25ml，用 0.5mol/L 氢氧化钠调至 PH7－8。在紫外光下照射 15min，通过强 碱性离子（氯离子型）交换柱（φ1cm×0.5cm）浓缩，用少量蒸馏水水洗，然 后用 1mol/L 氯化钠溶液洗脱亚硝酸根，然后分管收集洗脱液，每管 1ml，直至 所收集的洗脱液加入显色剂不显色为止。在管中各加入 1.0mlPH7 的磷酸缓冲溶 液、0.5ml 显色剂 A，摇匀，然后再加入 0.5ml 显色剂 B，待溶液呈玫瑰红色后， 在分光光度计以 550nm 波长下测定其吸光度，根据其吸光度，从标准曲线中查 得每管亚硝胺的含量，计算其总含量。 六、计算 X＝ m m1 ×1000 （3－2） 式中：X――挥发性 N－亚硝胺含量，μg/kg； m1――相当于挥发性 N－亚硝胺标准的量，μg； m――测定时样品溶液相当于样品的量，g。 注意事项 对于亚硝酸盐含量高的样品，由于二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下能结合 产生亚硝胺，因此，会影响 N－亚硝胺的测定结果。可以用同样的比色法计算 出亚硝酸盐相当于挥发性 N－亚硝胺含量 X0，然后再减去 X0得到实际样品中挥 发性 N－亚硝胺含量
58 1．亚硝胺标准曲线绘制 准确吸取亚硝胺标准溶液 0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10ml，分别放 入小培养皿中，在小培养皿中分别加入 PH7 的磷酸缓冲溶液，使溶液的总体积 为 2.0ml，摇匀。在紫外光下照 1min。然后依次加入 0.5ml 显色剂 A，摇匀， 再加入 0.5ml 显色剂 B，使溶液呈玫瑰红色后，分别在 550nm 波长下用分光光 度计测定其吸光度，然后绘制其标准曲线。 2．样品的制备 液体样品：称取 10.0－20.0g 样品（根据样品中亚硝胺的含量大小称量）， 移入 100ml 容量瓶中，加入 0.5mol/L 氢氧化钠溶液，调整其浓度为 1mol/L， 摇匀后过滤，收集滤液备用。 固体样品：将固体样品捣碎或研磨搅拌均匀，称取 20.0g，用正丁醇饱和过 的 1mol/L 氢氧化钠溶液将其转移入 100ml 容量瓶中至刻度，摇匀后浸泡过夜， 最后离心取清液备用。 3．挥发性 N－亚硝胺总量的测定 吸取样品 50ml 清液置于蒸馏瓶内，将其进行夹层保温水蒸气蒸馏，收集馏 出液 25ml，用 300g/L 醋酸溶液调节其 PH 值至 3－4。再继续蒸馏，再收集馏出 液 25ml，用 0.5mol/L 氢氧化钠调至 PH7－8。在紫外光下照射 15min，通过强 碱性离子（氯离子型）交换柱（φ1cm×0.5cm）浓缩，用少量蒸馏水水洗，然 后用 1mol/L 氯化钠溶液洗脱亚硝酸根，然后分管收集洗脱液，每管 1ml，直至 所收集的洗脱液加入显色剂不显色为止。在管中各加入 1.0mlPH7 的磷酸缓冲溶 液、0.5ml 显色剂 A，摇匀，然后再加入 0.5ml 显色剂 B，待溶液呈玫瑰红色后， 在分光光度计以 550nm 波长下测定其吸光度，根据其吸光度，从标准曲线中查 得每管亚硝胺的含量，计算其总含量。 六、计算 X＝ m m1 ×1000 （3－2） 式中：X――挥发性 N－亚硝胺含量，μg/kg； m1――相当于挥发性 N－亚硝胺标准的量，μg； m――测定时样品溶液相当于样品的量，g。 注意事项 对于亚硝酸盐含量高的样品，由于二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下能结合 产生亚硝胺，因此，会影响 N－亚硝胺的测定结果。可以用同样的比色法计算 出亚硝酸盐相当于挥发性 N－亚硝胺含量 X0，然后再减去 X0得到实际样品中挥 发性 N－亚硝胺含量
59 实训三、稻米中久效磷残留量的检测（气相色谱法） 一、目的 1、了解稻米中久效磷残留量的测定原理。 2、学会气相色谱仪的使用方法。 二、原理 久效磷属有机磷化合物，在富氢焰上燃烧时会以氢磷氧形式放射出特征光， 采用磷型火焰光度检测器检测特异性极强。稻米样品中久效磷采用丙酮作为提 取剂进行索氏提取，石油醚液液分配净化，二氯甲烷萃取，浓缩后气相色谱磷 型火焰光度检测器检测。 三、仪器与试剂 气相色谱仪，磷型火焰光度检测器，索氏抽提器，旋转蒸发器。 久效磷标准储备液：准确称取久效磷标准品，用无水乙醇配成浓度约 1mg/ml。 久效磷标准使用液：根据所用仪器的灵敏度将久效磷标准储备液用无水乙 醇稀释至适宜浓度。 丙酮、石油醚、二氯甲烷、无水乙醇、氯化钠、无水硫酸钠。 四、实验步骤 1、提取 称取约 40g 粉碎稻米样品，置于索氏抽提器滤纸筒中，加入 100ml 丙酮， 于 67～69℃水浴回流提取 6h，提取液经 50℃水浴旋转蒸发器上浓缩并定容至 3～5ml，待净化。 2、净化 待净化提取液倒入 250ml 的分液漏斗中，加入 100ml 的 1%硫酸钠溶液，混 匀，用石油醚(每次 25ml）分 4 次洗，弃去石油醚层。加入 25ml 饱和氯化钠溶 液，再用二氯甲烷（每次 25ml）萃取 4 次，合并二氯甲烷层，于 40℃的水浴旋 转蒸发器上浓缩近干，用无水乙醇溶解并定容至 0.5ml，待气相色谱分析。 3、检测 （1）色谱柱 玻璃柱，内径 3mm，长 1m，内装 40g/L OV-210/chromosorbWAWD-MCS(80～100 目)。 （2）温度 柱温 185℃，气化室和检测器温度 240℃。 （3）气体流速 载气：氮气 100ml/min；空气：200ml/min；氢气：150ml/min。 注意事项： 1．国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取试剂及分配净化试剂，如 AOAC， FDA 等采取与有机氯农药提取净化大致相同的方法来提取，净化有机磷农药， 即用乙腈或石油醚提取，用乙腈/水分配或乙腈/石油醚分配等方法净化。但乙 腈毒性大，价格贵，且不易购买，故本法采用二氯甲烷提取，并在提取时根据 样品性状加适量无水 Na2SO4、中性氧化铝、活性炭以脱水、脱油、脱色，基本 上一次完成提取、净化的目的。另有用各种吸附柱（如弗罗里矽土柱、活性炭 等）或用扫集共蒸馏方法净化
59 实训三、稻米中久效磷残留量的检测（气相色谱法） 一、目的 1、了解稻米中久效磷残留量的测定原理。 2、学会气相色谱仪的使用方法。 二、原理 久效磷属有机磷化合物，在富氢焰上燃烧时会以氢磷氧形式放射出特征光， 采用磷型火焰光度检测器检测特异性极强。稻米样品中久效磷采用丙酮作为提 取剂进行索氏提取，石油醚液液分配净化，二氯甲烷萃取，浓缩后气相色谱磷 型火焰光度检测器检测。 三、仪器与试剂 气相色谱仪，磷型火焰光度检测器，索氏抽提器，旋转蒸发器。 久效磷标准储备液：准确称取久效磷标准品，用无水乙醇配成浓度约 1mg/ml。 久效磷标准使用液：根据所用仪器的灵敏度将久效磷标准储备液用无水乙 醇稀释至适宜浓度。 丙酮、石油醚、二氯甲烷、无水乙醇、氯化钠、无水硫酸钠。 四、实验步骤 1、提取 称取约 40g 粉碎稻米样品，置于索氏抽提器滤纸筒中，加入 100ml 丙酮， 于 67～69℃水浴回流提取 6h，提取液经 50℃水浴旋转蒸发器上浓缩并定容至 3～5ml，待净化。 2、净化 待净化提取液倒入 250ml 的分液漏斗中，加入 100ml 的 1%硫酸钠溶液，混 匀，用石油醚(每次 25ml）分 4 次洗，弃去石油醚层。加入 25ml 饱和氯化钠溶 液，再用二氯甲烷（每次 25ml）萃取 4 次，合并二氯甲烷层，于 40℃的水浴旋 转蒸发器上浓缩近干，用无水乙醇溶解并定容至 0.5ml，待气相色谱分析。 3、检测 （1）色谱柱 玻璃柱，内径 3mm，长 1m，内装 40g/L OV-210/chromosorbWAWD-MCS(80～100 目)。 （2）温度 柱温 185℃，气化室和检测器温度 240℃。 （3）气体流速 载气：氮气 100ml/min；空气：200ml/min；氢气：150ml/min。 注意事项： 1．国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取试剂及分配净化试剂，如 AOAC， FDA 等采取与有机氯农药提取净化大致相同的方法来提取，净化有机磷农药， 即用乙腈或石油醚提取，用乙腈/水分配或乙腈/石油醚分配等方法净化。但乙 腈毒性大，价格贵，且不易购买，故本法采用二氯甲烷提取，并在提取时根据 样品性状加适量无水 Na2SO4、中性氧化铝、活性炭以脱水、脱油、脱色，基本 上一次完成提取、净化的目的。另有用各种吸附柱（如弗罗里矽土柱、活性炭 等）或用扫集共蒸馏方法净化
60 2．分析测定有机磷农药时，由于农药的性质不同，故应注意担体与固定液 的选择，一般原则是：被分离的农药是极性化合物，则选择极性固定液；若被 分离的农药是非极性化合物，则选择非极性固定液，若选择前者，各农药的出 峰顺序一般为极性小的农药先出峰，极性大的农药后出峰；若选择后者，则按 沸点高低出峰，低沸点的化合物先出峰。 3．有些热稳定性差的有机磷农药如敌敌畏在用气相色谱仪测定时比较困 难，主要原因是易被担体所吸附，同时因对热不稳定而引起分解。故可采用缩 短色谱柱到 1－1.3m，或减小固定液涂渍的厚度和降低操作温度（如本法）等 措施来克服上述困难。 实训四、香肠中亚硝酸盐的测定（盐酸萘乙二胺法） 一、目的 1、熟练掌握样品制备、提取的基本要求。 2、进一步学习并熟练掌握分光光度计的使用方法和技能。 3、盐酸萘乙二胺法测亚硝酸的原理和操作要点。 二、原理 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸 重氮化，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色颜料，在 538nm 波长下测定其吸光度与标准比较定量。本法最低检出限为 0.0001g/kg。 三、试剂 1．亚铁氰化钾溶液：称取 106g 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，溶于水后 稀释至 1000ml。 2．乙酸锌溶液：称取 220g 乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加 30ml 冰乙酸 溶于水，稀释至 1000ml。 3．饱和硼砂溶液：称取 5g 硼酸钠[Na2B4O7·10H2O]，溶于 100ml 热水中， 冷却后备用。 4．4g/L 对氨基苯磺酸溶液：称取 0.4g 对氨基苯磺酸，溶于 100ml 20%的 盐酸中，避光保存。 5．2g/L 盐酸萘乙二胺溶液：称取 0.2g 盐酸萘乙二胺，溶于 100ml 水中， 避光保存。 6．亚硝酸钠标准溶液：精密称取 0.1000g 在硅胶干燥器中干燥 24h 的亚硝 酸钠，用蒸馏水溶解移入 500ml 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液亚硝酸钠含 量为 200μg/ml。 7．亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液 5.00ml 置于 200ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液亚硝酸钠含量为 5μg/ml。 四、操作方法 1．样品处理 称取 5.0g 经绞碎混匀的样品，将其置于 50ml 烧杯中，加入 12.5ml 硼砂饱
60 2．分析测定有机磷农药时，由于农药的性质不同，故应注意担体与固定液 的选择，一般原则是：被分离的农药是极性化合物，则选择极性固定液；若被 分离的农药是非极性化合物，则选择非极性固定液，若选择前者，各农药的出 峰顺序一般为极性小的农药先出峰，极性大的农药后出峰；若选择后者，则按 沸点高低出峰，低沸点的化合物先出峰。 3．有些热稳定性差的有机磷农药如敌敌畏在用气相色谱仪测定时比较困 难，主要原因是易被担体所吸附，同时因对热不稳定而引起分解。故可采用缩 短色谱柱到 1－1.3m，或减小固定液涂渍的厚度和降低操作温度（如本法）等 措施来克服上述困难。 实训四、香肠中亚硝酸盐的测定（盐酸萘乙二胺法） 一、目的 1、熟练掌握样品制备、提取的基本要求。 2、进一步学习并熟练掌握分光光度计的使用方法和技能。 3、盐酸萘乙二胺法测亚硝酸的原理和操作要点。 二、原理 样品经沉淀蛋白质除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸 重氮化，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色颜料，在 538nm 波长下测定其吸光度与标准比较定量。本法最低检出限为 0.0001g/kg。 三、试剂 1．亚铁氰化钾溶液：称取 106g 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，溶于水后 稀释至 1000ml。 2．乙酸锌溶液：称取 220g 乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加 30ml 冰乙酸 溶于水，稀释至 1000ml。 3．饱和硼砂溶液：称取 5g 硼酸钠[Na2B4O7·10H2O]，溶于 100ml 热水中， 冷却后备用。 4．4g/L 对氨基苯磺酸溶液：称取 0.4g 对氨基苯磺酸，溶于 100ml 20%的 盐酸中，避光保存。 5．2g/L 盐酸萘乙二胺溶液：称取 0.2g 盐酸萘乙二胺，溶于 100ml 水中， 避光保存。 6．亚硝酸钠标准溶液：精密称取 0.1000g 在硅胶干燥器中干燥 24h 的亚硝 酸钠，用蒸馏水溶解移入 500ml 容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液亚硝酸钠含 量为 200μg/ml。 7．亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液 5.00ml 置于 200ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液亚硝酸钠含量为 5μg/ml。 四、操作方法 1．样品处理 称取 5.0g 经绞碎混匀的样品，将其置于 50ml 烧杯中，加入 12.5ml 硼砂饱
61 和溶液，搅拌均匀，用 70℃左右的水约 300ml，将样品全部转移入 500ml 容量 瓶中，置沸水浴中加热 15min 后，取出冷却至室温，然后边转动边加入 5ml 亚 铁氰化钾溶液，摇匀后再加入 5ml 乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混 匀，放置 0.5h，除去上层脂肪后将清液用滤纸过滤，弃去初滤液约 30ml，收集 滤液备用。 2．测定 吸取 40ml 上述滤液于 50ml 比色管中，另吸取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、 1.00、1.50、2.00、2.50ml 亚硝酸钠标准使用液（相当于 0、1、2、3、4、5、 7.5、10、12.5μg 亚硝酸钠），分别置于 50ml 比色管中。在样品管和标准系列 中分别加入 2ml4g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置 3－5min，再分别加入 1ml2g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀后静置 15min，然后以 2cm 比色 杯，用零管调节零点，于 538nm 波长下测定吸光度，并绘制标准曲线比较定量。 五、结果计算 X＝ 2 1 V V 1000 m A （3－4） 式中：X――样品中亚硝酸盐的含量，g/kg； m――样品质量，g； A――测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg； V1――样品处理液总体积，ml； V2――比色时吸取样品处理液体积，ml。 注意事项 1．显色时的 PH 值以 1.9－3.0 为宜，显色后稳定性与室温有关，一般认为 显色温度为 15－30℃，在 20－30min 内比色为好。 2．当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成偶氮化合物氧 化，使红色消失，对结果产生影响，可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的 方法，防止氧化。 实训五、蘑菇罐头中亚硫酸盐的测定（盐酸副玫瑰苯胺法） 一、目的 1、学习盐酸副玫瑰苯胺法的原理及操作要点。 2、熟悉分光光度法的基本操作技术。 二、原理 亚硫酸盐与四氯汞钠反应吸收后，生成稳定的化合物，再与甲醛和盐酸副 玫瑰苯胺作用，经分子重排后生成紫红色络合物，颜色的深浅与二氧化硫浓度 成正比，在 550nm 波长测定其吸光度，与标准系列比较定量。 三、试剂 1．四氯汞钠吸收液：称取 27.2g 氯化高汞及 11.9g 氯化钠，溶于水中并稀
61 和溶液，搅拌均匀，用 70℃左右的水约 300ml，将样品全部转移入 500ml 容量 瓶中，置沸水浴中加热 15min 后，取出冷却至室温，然后边转动边加入 5ml 亚 铁氰化钾溶液，摇匀后再加入 5ml 乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混 匀，放置 0.5h，除去上层脂肪后将清液用滤纸过滤，弃去初滤液约 30ml，收集 滤液备用。 2．测定 吸取 40ml 上述滤液于 50ml 比色管中，另吸取 0、0.20、0.40、0.60、0.80、 1.00、1.50、2.00、2.50ml 亚硝酸钠标准使用液（相当于 0、1、2、3、4、5、 7.5、10、12.5μg 亚硝酸钠），分别置于 50ml 比色管中。在样品管和标准系列 中分别加入 2ml4g/L 对氨基苯磺酸溶液，混匀后静置 3－5min，再分别加入 1ml2g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀后静置 15min，然后以 2cm 比色 杯，用零管调节零点，于 538nm 波长下测定吸光度，并绘制标准曲线比较定量。 五、结果计算 X＝ 2 1 V V 1000 m A （3－4） 式中：X――样品中亚硝酸盐的含量，g/kg； m――样品质量，g； A――测定用样液中亚硝酸钠的含量，μg； V1――样品处理液总体积，ml； V2――比色时吸取样品处理液体积，ml。 注意事项 1．显色时的 PH 值以 1.9－3.0 为宜，显色后稳定性与室温有关，一般认为 显色温度为 15－30℃，在 20－30min 内比色为好。 2．当样品中亚硝酸盐含量高时，过量的亚硝酸盐可以将生成偶氮化合物氧 化，使红色消失，对结果产生影响，可以采取先放入试剂，然后再滴加试液的 方法，防止氧化。 实训五、蘑菇罐头中亚硫酸盐的测定（盐酸副玫瑰苯胺法） 一、目的 1、学习盐酸副玫瑰苯胺法的原理及操作要点。 2、熟悉分光光度法的基本操作技术。 二、原理 亚硫酸盐与四氯汞钠反应吸收后，生成稳定的化合物，再与甲醛和盐酸副 玫瑰苯胺作用，经分子重排后生成紫红色络合物，颜色的深浅与二氧化硫浓度 成正比，在 550nm 波长测定其吸光度，与标准系列比较定量。 三、试剂 1．四氯汞钠吸收液：称取 27.2g 氯化高汞及 11.9g 氯化钠，溶于水中并稀