特殊毒性试验 致突变试验 ■致畸试验 致癌试验
特殊毒性试验 ◼致突变试验 ◼致 畸 试 验 ◼致 癌 试 验
目的意义 研究对遗传物质是否有损伤,是 否会引起肿瘤、衰老及畸胎等 ■特殊毒性试验存在着种属差异性 定性差异 定量差异
目的意义 ◼ 研究对遗传物质是否有损伤，是 否会引起肿瘤、衰老及畸胎等 ◼ 特殊毒性试验存在着种属差异性 ▪ 定性差异 ▪ 定量差异
定性差异 反应停对家兔和7种灵长类动物致畸,但至少 对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家狗、3 种田鼠和8种灵长类动物不致畸 可的松对兔子和小鼠强力致畸,但对大鼠不致 畸 硫唑嘌呤对大鼠不致畸,但对兔子强致畸 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形,但对兔子却 引起脸和内脏畸形
定性差异 ◼ 反应停对家兔和７种灵长类动物致畸，但至少 对10种品系大鼠、15种品系小鼠、2种家狗、３ 种田鼠和８种灵长类动物不致畸 ◼ 可的松对兔子和小鼠强力致畸，但对大鼠不致 畸 ◼ 硫唑嘌呤对大鼠不致畸，但对兔子强致畸 ◼ 氨磺丁脲引起大鼠、小鼠眼畸形，但对兔子却 引起脸和内脏畸形
定量差异 致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显 表人类与动物致畸剂量比较 药物最低致畸剂量(kg/d)人与动物比值 动物 反应停0.510mg兔2.5mg 5-2.5 氨基喋呤50μg大鼠100g 氨甲喋呤42μg大鼠200g 乙烯雌酚20-80gg恒河猴200g10-25 苯妥英钠2mg小鼠50mg
定量差异 ◼ 致畸剂量在人与动物、动物与动物间差异明显 表 人类与动物致畸剂量比较 药物 最低致畸剂量（/kg/d) 人与动物比值 人 动 物 反应停 0.5-1.0mg 兔 2.5mg 5-2.5 氨基喋呤 50μg 大鼠 100μg 2 氨甲喋呤 42μg 大鼠 200μg 4.8 乙烯雌酚 20-80μg 恒河猴200μg 10-2.5 苯妥英钠 2mg 小鼠 50mg 25
致突变谜验 微生物回复试验(Ames试验) +哺乳动物培养细胞基因突变试验 +果蝇伴性隐性致死试验 染色体畸变试验 +啮齿动物显性致死试验 +精原细胞染色体畸变试验 ■动物微核试验 +程序外DNA合成(UDS)试验 +SOs显色试验
致突变试验 ◼ 微生物回复试验(Ames试验） ▪ +哺乳动物培养细胞基因突变试验 ▪ +果蝇伴性隐性致死试验 ◼ 染色体畸变试验 ▪ +啮齿动物显性致死试验 ▪ +精原细胞染色体畸变试验 ◼ 动物微核试验 ▪ +程序外DNA合成(UDS)试验 ▪ +SOS显色试验
微生物回复试验 ■菌株:组胺酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌 S Typhimurium),采用TA98、100、97、102,检定 符合要求,80℃或液氮冻存备用 剂量:由药物对细菌的毒性和溶解度决定 最高剂量:a.-般5mg/皿,b,最高溶解度, c根据杀菌情况确定最大浓度 最低剂量:一般1pg/皿或0g/皿。 剂量级:5个以上
微生物回复试验 ◼ 菌 株 : 组 胺 酸 缺 陷 型 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (S.Typhimurium), 采用TA98、100、97、102, 检定 符合要求, -80℃或液氮冻存备用 ◼ 剂量：由药物对细菌的毒性和溶解度决定 ▪ 最高剂量：a.一般5mg／皿，b.最高溶解度， c.根据杀菌情况确定最大浓度 ▪ 最低剂量：一般1μg／皿或0.1μg／皿。 ▪ 剂量级：5个以上
微生物回复谜验 代谢活化:加肝脏微粒体酶(9和不加9平行条 件下测试 ■对照:阴性、阳性对照和S9对照 ■方法:标准平板法或预培养法,48h观察结果,如 菌落太小,可继续培养并延长到7h观察结果。每 浓度至少三皿,实验至少重复一次 结果判定:①受试物所诱发的回变菌落数(x±s) 增加,超过对照2倍,量-效关系;②某测试点超 过对照2倍以上,呈现可重复的并有统计学意义的 增加。符合上述任何一条即可判为阳性
微生物回复试验 ◼ 代谢活化：加肝脏微粒体酶(S9)和不加S9平行条 件下测试 ◼ 对照：阴性、阳性对照和S9对照 ◼ 方法：标准平板法或预培养法，48h观察结果，如 菌落太小，可继续培养并延长到72h观察结果。每 一浓度至少三皿，实验至少重复一次 ◼ 结果判定：①受试物所诱发的回变菌落数(ｘ±ｓ) 增加，超过对照2倍，量--效关系；②某测试点超 过对照2倍以上，呈现可重复的并有统计学意义的 增加。符合上述任何一条即可判为阳性
微生物回复谜 如某些药物有明显杀菌作用,可改用哺乳动物细 胞基因突变试验 如某些阳性或可疑阳性时,可选择哺乳动物培养 细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
微生物回复试验 ◼ 如某些药物有明显杀菌作用，可改用哺乳动物细 胞基因突变试验 ◼ 如某些阳性或可疑阳性时，可选择哺乳动物培养 细胞基因突变试验或果蝇伴性隐性致死试验
哺乳动物培养细胞条色体畸变试验 ■细胞:建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL),需定期 检查核型和有无支原体等污染。-80℃或液氮 冻存 剂量:高剂量以50%细胞生长抑制浓度为基准, 最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采 用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少3 个剂量 代谢活化:应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微 粒体酶(S9)进行体外代谢活化试验
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 ◼ 细胞: 建议首选中国仓鼠肺细胞(CHL), 需定期 检查核型和有无支原体等污染。-80℃或液氮 冻存 ◼ 剂量：高剂量以50％细胞生长抑制浓度为基准， 最高不要超过10mM分子量。溶解受限时可采 用饱和浓度。中低剂量用倍量稀释法。至少３ 个剂量 ◼ 代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝微 粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验
哺乳动物培养细胞染色畸变谜验 药物作用时间:药物和细胞接触非活化组作 用24h和48h收获细胞,代谢活化组作用6小时 以上 ■标本制作时间:药物和细胞接触后起算,分 别在24h和48h收获细胞 对照:空白、溶剂、阳性和S9对照 镜检:每种浓度至少观察100个中期分裂相, 在油镜下分别记录染色体的结构畸变,多倍 体以及畸变细胞数和畸变类型
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 ◼ 药物作用时间: 药物和细胞接触非活化组作 用24h和48h收获细胞, 代谢活化组作用6小时 以上 ◼ 标本制作时间：药物和细胞接触后起算，分 别在24h和48h收获细胞 ◼ 对照：空白、溶剂、阳性和Ｓ９对照 ◼ 镜检：每种浓度至少观察100个中期分裂相， 在油镜下分别记录染色体的结构畸变，多倍 体以及畸变细胞数和畸变类型