新乡医学院教案首页 课程名称 《卫生化学》 授课题目 高效液相色谱测定苯甲酸 授课对象 2012级本科预防医学专业 1、讲解液相色增实验原理、方法及仪器构造 30min 会制工作曲线及样品的测定 7Omin 时间分配 3、 实验结果的分析、小结 20min 课时目标 高效液相色谱法进行定量分析的喷 熟悉高效液相色谱仪器的使用方法： 授课重点 1、高效液相色谱仪器的结构和开关机顺序 2、高效液相色谱仪器测定方法的选择。 授课难，点 1、外标法标准工作曲线的绘制： 2、高效液相色谱仪器使用方法。 授课形式 小班实验课教学 授课方法 井授结合示教、练习 参考文献 《卫生化学》，郭爱民主编，第六版 《卫生化学实验指导》，胡曼玲主编 守验中流动相时滤知脱气的作用是什么？ 思考题 高效液相色谱和气相色谱的进样有何区别？ 散研室主任（签字) 课程负责人（签字） 教研室主任 及课程负责 人签字 月 日 年月日
高效液相色谱测定苯甲酸 试验准备： 0.02mo/L乙酸胺 NH4CO33g+乙酸1g 配5.0mg/ml苯甲酸 0.2500g苯甲酸→50ml(0.5 gNaHC03+20ml水) 出峰17-20min,响应良好 实验时：配2-3个系列：1mgml、3mg/ml、5mg/ml 一，实验目的： 1、掌握高效液相色谱法测定苯甲酸的原理及实验方法 2、掌握谱析L6000高效液相色谱仪的使用方法。 3、熟悉饮料中苯甲酸的样品前处理方法。 二.实验原理： 样品除去二氧化碳和乙醇后，调pH至近中性，过滤后进高效液 相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230mm处检 测。根据色谱峰的保留时间定性，利用色谱峰面积在一定范围内与 浓度呈线性关系而进行定量。 三.仪器与试剂 1.仪器 北京谱析L6000高效液相色谱仪（配紫外检测器，C18反相色谱 柱；滤膜过滤器，0.45μm有机滤膜，超声波提取仪，离心机 2.试剂 2
苯甲酸（对照品）甲醇（色谱纯）苯甲酸的标准储备液 (5.0mg/mL) 四.实验步骤 1.称取10g样品，放入小烧杯中，微微加热搅拌除去二氧化碳和乙 醇，用稀氨水调节pH至近中性，倒入50mL容量瓶中，加蒸馏水定 容至刻度，混匀，用微孔滤膜过滤，滤液备用。 2.参考色谱条件：C18色谱柱(25cm×0.46cm,5um);流动相：甲醇 /0.2mol/L醋酸铵溶液(5/95)；流速：1.0mL/min,检测波长230nm; 进样量：20uL。 3标准曲线绘制及样品测定 (1)定性分析：根据苯甲酸标准溶液的出峰时间定性分析： (2)标准曲线的配制及测定：取标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.00ml 于10mL的容量瓶中，以流动相定容。取20μL进样，得标准溶液色 谱图，以峰面积对浓度进行线性回归，求回归方程。 (3)样品测定：取20L样品液进样，得样品色谱图，将峰面积代 入回归方程，计算测定液中苯甲酸的浓度。 五.数据处理 从线性回归方程中求得的苯甲酸的浓度代入下述公式，计算饮料中 苯甲酸的总量 cXVo p=m×1000 c—标准曲线中查得的相应的苯甲酸的含量
p一样品中被测物的含量，mgg V。一样品定容体积，ml m一样品的质量，g 六.注意事项 1.将被测溶液加热搅拌除去二氧化碳。 2.测定需调节溶液pH至近中性，保护仪器且以免影响苯甲酸测定的 保留时间。 3.苯甲酸在230nm有较强吸收，因此，选用230nm作为检测波长。 4.定量环20μL,进样量60~100uL最佳。 5.每次进样前洗进样针，实验结束以甲醇清洗进样口。 七、思考题 1.实验中流动相过滤和脱气的作用是什么？ 2.高效液相色谱和气相色谱的进样有何区别？