新乡医学院实验课教案首页 课程名称 《食品理化检验》 授课教师 高霞 授课题目 保健食品中褪黑素的测定一一高效液相色谱法 授课对象 2012级本科卫生检验专业 1、讲解实验原理及方法 30min 2、样品前处理、工作曲线的绘制及样品的测定 150min 时间分配 3、实验结果的分析、小结 20min 1、掌握高效液相色谱法测定褪黑素的原理、超声提取样品中褪黑 素的方法及定性定量的方法。 课时目标 熟悉谱析1600高效液相色谱仪的使用方法 3、了解保健食品中褪黑素测定的意义及注意事项。 授课重点 1、高效液相色谱法测定褪黑素的原理及色谱条件的确定 授课难点 高效液相色谱法测定褪黑素色谱条件的确定 授课形式 小班实验课教学 授课方法 讲授结合示教、练习 参考文献 《食品理化检验》，黎源倩主编，人民卫生出版社，第2版(2015.1) 《卫生检验检疫实验教程：卫生理化检验分册》，高蓉主编 思考题 若样品中含有大量油脂，样品前处理方法是否需要改进？如何改 教研室主任（签字) 课程负责人（签字） 教研室主任 及课程负责 人签字 月 月日
保健食品中褪黑素的测定 -高效液相色谱法 褪黑素又称松果体素、脑白金，是哺乳动物脑部松果体分泌的一 种吲哚类激素。它可以控制机体睡眠与清醒的生物时钟，同时也具有 清除体内自由基、调节免疫功能、抑制雌激素和催乳素的分泌等作用。 褪黑素摄入量过高，会造成一定危害，原卫生部已批准褪黑素在功能 性食品中的应用，其功能仅限于改善睡眠，适宜人群为中老年人。每 天推荐剂量不可超过3mg。 【实验目的】 1、掌握高效液相色谱法测定褪黑素的原理、超声提取样品中褪黑素 的方法及定性定量的方法。 2、熟悉谱析L600高效液相色谱仪的使用方法。 3、了解保健食品中褪黑素测定的意义及注意事项 【实验原理】 样品中的褪黑素经甲醇溶解，稀释过滤后，上清液注入高效液相色 谱仪分离分析，紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标 法定量。 方法适用于保健食品中褪黑素的测定。 【仪器与试剂】 仪器 北京谱析L600高效液相色谱仪（配紫外检测器，C18反相色谱柱： 滤膜过滤器，0.45um有机滤膜，超声波提取仪，离心机
试剂 褪黑素（对照品）：甲醇（色谱纯）：冰乙酸溶液(0.2%)吸取1.00mL 冰乙酸，稀释至500mL纯水中；褪黑素标准应用液(1mgmL) 【实验步骤】 样品前处理 (1)样品提取 (1)用研钵将片剂或胶囊研成粉未并混合均匀。准确称取0.2g 于10mL刻度试管中，加乙醇溶解，用超声波提取仪提取20min,离 心5分钟(3500rmin),上清液转入25mL的容量瓶中；残渣加10mL 甲醇，超声提取20min,离心5分钟(3500r/min,上清液并入25mL 的容量瓶中；以流动相定容，过滤备用(0.45μm的有机系滤膜)。 (2)参考色谱条件： C18色谱柱(25cm×0.46cm,5um; 流动相：甲醇0.2%冰乙酸溶液(50/50)：流速：1.0mL/min,检测波长 222nm:进样量：20uL。 标准曲线绘制及样品测定 (1)定性分析：根据褪黑素标准溶液的出峰时间定性分析； (2)标准曲线的配制及测定：取标准溶液0.10,0.20,0.60,0.80 1.00mL于10mL的容量瓶中，以流动相定容。取20uL进样，得标准 溶液色谱图，以峰面积对浓度进行线性回归，求回归方程。 (3)样品测定：取20L样品液进样，得样品色谱图，将峰面积代 入回归方程，计算测定液中褪黑素的浓度
【数据处理】 从线性回归方程中求得的褪黑素的浓度代入下述公式，计算 脑白金中褪黑素的总量 r=P×25 1000×m X—脑白金中褪黑素的含量，mgg p一从回归方程中计算出的样品中褪黑素的浓度，gmL m—样品的质量，g。 下—试样溶液的稀释倍数，g 计算结果保留两位有效数字。 【注意事项】 1.为了使褪黑素充分被提取，分别以乙醇和甲醇为溶剂两次超声波 提取，可得到较好的回收率。 2.褪黑素在222nm和275nm处均有吸收，若222nm处背景干扰大， 也可选用275nm作为检测波长。 3.定量环20μL,进样量60~100uL最佳。 4.每次进样前洗进样针，实验结束以甲醇清洗进样口。 【思考题】 若样品中含有大量油脂，样品前处理方法是否需要改进？如何改进？