食品中总抗坏血酸 的测定 一分子荧光法
一、 实验目的 ·1、掌握分子荧光法测定食品中抗坏血酸的基 本原理和方法。 ·2、熟悉样品中总抗坏血酸的提取操作步骤 ·3、了解食品中抗坏血酸测定的意义
二、实验原理 ·样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸 后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧 光强度与脱氢型抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比， 以此测定食品中抗坏血酸和脱氢型抗坏血酸的总量。 活性炭氧化作用： 将活性炭置于(1：9)的盐酸中加热回流1~2小时，过滤，用水洗至滤液 中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥。这样，活性炭形成多孔 微晶结构，具有大的比表面积。大的比表面积吸附氧，遇还原型抗坏血 酸时，在活性炭表面发生氧化-还原反应，使抗坏血酸转换为脱氢型抗坏 血酸。 ·方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗血酸的测定
三、仪器与试剂 3.1仪器 安捷伦荧光分光光度计；组织捣碎机 3.2试剂 偏磷酸-乙酸溶液；硫酸溶液；偏磷酸-乙酸硫酸溶液；乙酸 钠溶液；硼酸乙酸钠溶液；邻苯二胺溶液，抗坏血酸标液， 百里酚蓝指示剂(pH4 为蓝色)
四、实验步骤 4.1样品处理 (1)样品提取 称取100g新鲜样品，加100g偏磷酸-乙酸溶液打成匀浆。 称取20g匀浆于100ml容量瓶中。 加1滴百里酚蓝指示剂。若成红色，用偏磷酸-乙酸溶液 稀释至刻度，若成黄色或蓝色，用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液 稀释至刻度(pH=1.2)。 混匀，过滤，滤液备用。 (2)氧化处理 取样品滤液、标准应用液各50mL于两只100mL具塞三 角瓶中，分别加入1g活化后活性炭，用力振摇1min,过 滤，收集滤液，得样品氧化液和标准氧化液
(2)制备试液、标液及其空白 各取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中，分别标 记“标准”、“标准空白”；各取10mL样品氧化液于两 个100mL容量瓶中，分别标记“样品”、“样品空自”。 于标准空白及样品空白中各加入5mL硼酸-乙酸钠溶液， 摇动15min,用水稀释至刻度，4℃冰箱中放置2~3小时， 取出备用。 于样品及标准溶液中各加入500gL乙酸钠溶液5mL,用 水稀释至刻度，备用。 硼酸的作用：食物中的丙酮酸，也与邻苯二胺反应生成一种荧光 物质，干扰测定。加入硼酸后，硼酸与脱氢型抗坏血酸发生螯合 作用生成的硼酸脱氢型螯合物不与邻苯二胺作用。丙酮酸则不会 和硼酸发生此作用，仍可以与邻苯二胺生成荧光物质。因此加入 硼酸-乙酸钠后溶液的荧光强度为丙酮酸与邻苯二胺生成的荧光 物质产生的，为总抗血酸测定的背景值
四、实验步骤 4.2样品测定 取上述标准溶液0.50,1.00,1.50,2.00于10mL比色管中， 再用水补充至2.00mL: 另取标准空白溶液、样品空白溶液及样品溶液各 2.00mL,分别置于10mL比色管中； 向各管中迅速加入5.00mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在 室温下反应35min。 以标准系列中浓度最大管在安捷伦荧光分光光度计上找 最大激发波长和最大发射波长。在最大发射波长下测定 各管的荧光强度。以浓度为横坐标，相对荧光强度为纵 坐标绘制标准曲线，求线性拟合方程，计算样品中总抗 坏血酸的浓度
五、数据处理 从线性回归方程中求得的总抗坏血酸的浓度代入下述公式，计算 样品中抗坏血酸的总含量 Y=(pxv) F× 100 m 1000 X一样品中抗坏血酸的总含量，mg/100g 一由标准曲线得到的测定试液的浓度，gmL V一荧光反应中测定试液的体积，ugmL m 样品的质量，g F一试样溶液的稀释倍数，g 计算结果表示到小数点后一位
六、注意事项 ·1.4%偏磷酸溶液和2%的草酸溶液均有抑制抗坏血 酸氧化酶的作用，防止抗坏血酸被破坏，影响测定 结果的准确性。 ·2抗坏血酸易光解，反应在暗处进行。 ·3.活性炭对抗坏血酸的氧化作用是基于其表面表面 吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分， 测定结果偏低，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作 用，使结果也偏低。 ·4荧光测定影响因素多，为减小误差，标准管和样 品管应同时测定。 &A