新乡医学院教案首页 课程名称 生物材料检验 授课题目 高效液相色谱法测定尿中马尿酸和甲基马尿酸 授课对象 本科2012级卫生检验专业 1.介绍马尿酸和甲基马尿酸及我国规定的尿中马尿酸职业接触限 5分钟 2.高效液相色谱法测定尿中马尿酸和甲基马尿酸的原理5分钟 时间分配 3.尿中马尿酸和甲基马尿酸含量测定 4. 170分钟 5分钟 共200分钟 1.了解尿中马尿酸和甲基马尿酸含量测定的意义。 课时目标 2. 掌握尿中马尿酸和甲基马尿酸高效液相色谱法测定的基本原理利 万法。 授课重点 高效液相色谱法测定尿中马尿酸和甲基马尿酸的操作 授课难点 马尿酸和甲基马尿酸的标准曲线绘制 授课形式 小班实验教学 授课方法 板书结合示教 教材：《生物材料验》 参考文献 国标：《VST53-1996尿中马尿酸、甲基马尿酸的高效液相色谱测定 方法》 思考题 为什么要绘制马尿酸和甲基马尿酸的标准曲线？ 教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 教研室主任 及课程负责 人签字 年月日 年月日
教案续页 讲义内容 教学组织与 教学安排 高效液相色谱法测定尿中马尿酸和甲基马尿酸 一、实验目的： 1.了解尿中马尿酸和甲基马尿酸含量测定的意义。 2.掌握尿中马尿酸和甲基马尿酸高效液相色谱法测定的 基本原理和方法。 理论知识回顾： 基础知识： 在《第四章芳香烃及其代谢产物的测定》中已经讲 提问尿中马尿酸 过，甲苯在体内的主要代谢产物为马尿酸，化学名苯甲酰 和甲基马尿酸测 定的意义。 氨基乙酸，二甲苯在体内的主要代谢产物为甲基马尿酸， 化学名甲基苯甲酰氨基乙酸。 甲苯的生物监测指标之一一尿中马尿酸：接触甲苯 讲解尿中马尿酸 2h后，尿中马尿酸浓度迅速升高，停止接触前在尿中含 作为甲苯非特异 性生物监测指标 量达到最高水平；在停止接触后又急剧下降，一般在停止 的原因 接触16~18h后，尿中马尿酸含量恢复至正常水平。所以， 马尿酸可以作为甲苯的生物监测指标。值得注意的是，正 常人尿中也含有马尿酸，但其含量水平因个体差异波动较 大，主要影响因素有膳食和某些药物的摄入，其中水杨酸 类药物的影响最大。另外，接触乙苯、苯乙烯、苯甲醛
苯甲醇和苯甲酸等有机化合物也可使人尿中马尿酸含量 增高。所以，马尿酸作为甲苯的生物监测指标是非特异性 的。但因其测定方法简便，易于操作，在接触人群的调查 中，利用其测定结果来评价人体的甲苯接触量还是有一定 的参考价值。呼吸气中甲苯和静脉血中甲苯是甲苯接触的 特异性监测指标。 二甲苯的生物监测指标之一一尿中甲基马尿酸： 介绍尿中马尿酸 般情况下，正常人尿中甲基马尿酸含量很低，当接触二甲 作为 甲苯较为 异的生物监测 苯后，尿中甲基马尿酸含量明显增高，而且排出量与二甲 指标。 苯接触量呈明显相关关系，所以甲基马尿酸是一个较特异 的、并且应用广泛的二甲苯生物监测指标。 职业接触限值： 尿中马尿酸职业接触限值我国为班末1mol/mol肌酐 介绍我国规定的 (1.5gg肌酐)或停止接触后11mmol/L(2.0g/L)。尿中 尿中马尿酸和美 国规定的甲基马 甲基马尿酸含量我国暂无规定限值。美国ACGH提出的 尿酸职业接触限 BEI为1.5gg肌酐（班末）。文献建议我国职业接触二甲 苯的代谢产物尿中甲基马尿酸的生物接触限值为班末尿 0.3gg肌酐或0.4gL。 尿中马尿酸和甲基马尿酸的测定： 尿中马尿酸的测定方法主要有分光光度法、气相色谱 介绍尿中马尿酸 法和高效液相色谱法。尿中马尿酸和甲基马尿酸可在衍生 和甲基马尿酸测 定的方法。 成酯后用气相色谱法进行测定。该法可将马尿酸、甲基马 尿酸与尿中其他干扰成分分离，但操作繁琐。现在最为常
用的分析方法是高效液相色谱法，该法可将马尿酸、甲基 马尿酸与尿中其他共存成分分离，方法灵敏度高，筒便快 速，是目前测定尿中马尿酸和甲基马尿酸的理想方法。本 实验采用高效液相色谱法测定尿中马尿酸和甲基马尿酸。 二、实验原理 尿液经酸化后，乙酸乙酯萃取其中的马尿酸(HA)和 介绍高效液相色 谱法测定尿中马 甲基马尿酸(MHA),反相C18液相色谱柱分离，紫外检 尿酸和甲基马尿 测器(254nm)检测，以保留时间定性，峰面积定量。 酸的原理。 三、仪器和试剂 1.仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器；离心机；恒温水 介绍实验仪器和 浴锅；旋涡混合器；具塞离心管，10mL;微量取样器， 试别。 50L:聚乙烯塑料瓶，100mL;尿比重计。 2.试剂：实验用水，超纯水；盐酸，P201.19gmL;冰乙 酸，P201.05gmL;氯化钠；甲醇；乙酸乙酯；盐酸溶液， 1+l;马尿酸，色谱纯；甲基马尿酸，色谱纯；HA和MHA 标准溶液（称取HA和MHA各50.00mg,加水溶解，移 入50mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液1mL=1mgHA 或MHA,4℃保存备用)。 四、操作步骤 1.采样、运输和保存：用聚乙烯塑料瓶收集正常人尿样 (随意尿)，尽快测量比重，按0.1%(VV)的比例加 入盐酸，室温下运输。于4℃冰箱中可保存2周，也 指导学生实验操 可将样品提取、蒸干，于常温保存。 作。 2.样品处理：取1.0mL尿样于离心管中：加入0.1mL盐 酸溶液，0.3g氯化钠，4mL乙酸乙酯：于旋涡混合
器上混合1min,以1000r/min速度离心5min,静置 分层，上层为乙酸乙酯层：取0.4mL乙酸乙酯层溶液 于具塞试管中，置于70℃水浴挥发至干；加1mL水 溶解残留物。 3.试剂空白：取1.0mL水于离心管中，后续处理同样品 处理。 4.马尿酸和甲基马尿酸标准溶液的配制：取4支离心管， 标号为0-3，按表1，向各管中依次加入标准溶液和水。 5.仪器操作条件 色谱柱：150mm,内径4.6mm,不锈钢柱。 特别提醒马尿酸 柱填料：C1g键合多孔硅胶，5um 和甲基马尿酸标 准管系列的配 柱温：室温。 流动相：甲醇+水+冰乙酸=20+80+0.01： 管（含0管）。 流速：1mL/min。 紫外检测器：波长：254nm。 表1马尿酸和甲基马尿酸标准管的配制 管号■ 0123 1mgmL标准 0.000.150.200.25 溶液(mL) 水(mL)1.000.850.800.75 马尿酸含量 0.000.150.20.25 (mg) 2甲基马尿酸 0.000.150.200.25 含量(mg) 3-甲基马尿酸0.000.150.200.25
含量(mg) 4-甲基马尿酸 0.000.150.20025 含量(mg) 6.标准曲线的绘制：标准管按样品处理方式进行处理后， 取20L标准品注入色谱仪测定，以保留时间定性， 峰面积定量。以马尿酸或甲基马尿酸的峰面积为纵坐 标，马尿酸或甲基马尿酸的含量（按上述条件操作， 特别提程本字哈 中限于时间 最后进样20L,相当于0.00,0.30,0.40,0.50g) 准管没有按照样 为横坐标，绘制标准曲线。 品处理方式同样 处理，不是一个 全过程的标准曲 7.样品测定：取20L处理好的样品残留物注入色谱仪测 线，只是最后定 量的一个标准曲 定，同样以保留时间定性，峰面积定量。从标准曲线上 线。 查出马尿酸或甲基马尿酸的含量。 8.试剂空白测定：同样品测定。 五、结果计算 1.按式(1)计算尿样换算成标准比重(1.020)下的浓度 校正系数(k)。 介绍结果计算方 法。 k=(1.020-1.000)/(实测比重-1.000)…式(1) 2.按式(2)计算马尿酸或甲基马尿酸的浓度。 X=(m*1000/W)k…式(2》 式中：X一尿中马尿酸或2甲基马尿酸(3甲基马尿酸 4-甲基马尿酸)的浓度，mgmL: m一由标准曲线上查得的马尿酸或2甲基马尿酸(3.甲 基马尿酸、4甲基马尿酸)的含量，μg:
V一进样体积，L。 六、分析与讨论 1.正常人尿中马尿酸和甲基马尿酸含量的影响因素。 提醒学生分析讨 论事项。 2.高效液相色谱法以保留时间定性、峰面积定量受鄂些因 素影响？ 七、注意事项 提醒学生实验中 1.尿样采集、运输、保存。 的注意事项。 2.尿样处理：酸化，萃取。 3.高效液相色谱仪操作。 教案末页
1.本实验中高效液相色谱柱需平衡一段时间，保留时间较长，色谱柱用后 需清洗，导致总共所需时间较长。 2,尿中马尿酸和甲基马尿酸用乙酸乙酯萃取后水浴挥发千的时问较长。 3.可以在平衡柱子时准备尿样，进行酸化、萃取等操作，在测定标准管系 列的时候进行水浴挥发，可以节约一些时问。 小结 1.本次试验从14：30到晚上22：45左右完全结束，上样共6个。 2.影响本次时问的最关键的步骤是萃取后吸取的乙酸乙酯层含有大量的 盐，导致水分过多，水浴挥发很难，可能是由于离心结束、没有静置分层 就吸取了乙酸乙酯层，预实验时使用3000rpm离心5min,未出现此问题 以后需特别注意。 教学后记