高效液相色谱法测定尿中马尿酸和 甲基马尿酸 王寅彪
⊙ 实验目的 1.了解尿中马尿酸和甲基马尿酸含量测定的 意义。 2.掌握尿中马尿酸和甲基马尿酸高效液相色 谱法测定的基本原理和方法
⊙ 肌酐测定的意义 1.甲苯的生物监测指标之一一尿中马尿酸：接触甲苯 2h后，尿中马尿酸浓度迅速升高，停止接触前在尿 中含量达到最高水平；在停止接触后又急剧下降， 般在停止接触16~18h后，尿中马尿酸含量恢复至正 常水平。 2. 二甲苯的生物监测指标之一一尿中甲基马尿酸： 般情况下，正常人尿中甲基马尿酸含量很低，当接触 二甲苯后，尿中甲基马尿酸含量明显增高，而且排出 量与二甲苯接触量呈明显相关关系，所以甲基马尿酸 是一个较特异的、并且应用广泛的二甲苯生物监测指 标
⊙ ·尿中马尿酸职业接触限值我国为班末1 mol/mol肌酐(1.5g/g肌酐)或停止接触后 11mmol/L(2.0g/L)。尿中甲基马尿酸含 量我国暂无规定限值。美国ACGH提出的 BE为1.5g/g肌酐（班末）。文献建议我国 职业接触二甲苯的代谢产物尿中甲基马尿 酸的生物接触限值为班末尿0.3g/g肌酐或 0.4g/L
⊙ 尿中马尿酸和甲基马尿酸的测定： ·主要有分光光度法、气相色谱法和高效液 相色谱法。 ·尿中马尿酸和甲基马尿酸可在衍生成酯后 用气相色谱法进行测定。 ·现在最为常用的分析方法是高效液相色谱 法，该法可将马尿酸、甲基马尿酸与尿中 其他共存成分分离，方法灵敏度高，简便 快速。本实验采用高效液相色谱法测定尿 中马尿酸和甲基马尿酸
@ 二、实验原理 ·尿液经酸化后，乙酸乙酯萃取其中的马尿 酸(HA)和甲基马尿酸(MHA),反相C18 液相色谱柱分离，紫外检测器(254nm)检 测，以保留时间定性，峰面积定量
@ 仪器和试剂 1.仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器；离心机；恒温水 浴锅；旋涡混合器；具塞离心管，10L;微量取样器， 50uL:聚乙烯塑料瓶，100mL:尿比重计。 2.试剂： 实验用水，超纯水；盐酸，P20=1.19g/mL；冰乙酸， P20=1.05g/mL:氯化钠；甲醇；乙酸乙酯；盐酸溶液， 1+1;马尿酸，色谱纯；甲基马尿酸，色谱纯；HA和MHA 标准溶液（称取HA和MHA各50.00mg,加水溶解，移入 50mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液1mL=1mgHA或 MHA,4℃保存备用)
@ 操作步骤 1.采样、运输和保存：用聚乙烯塑料瓶收集正常人尿样 (随意尿)，尽快测量比重，按0.1%(VN)的比例 加入盐酸，室温下运输。于4°C冰箱中可保存2周， 也可将样品提取、蒸干，于常温保存。 2.样品处理：取1.0mL尿样于离心管中；加入0.1mL盐 酸溶液，0.3g氯化钠，4L乙酸乙酯；于旋涡混合器 上混合1min,以1000 r/min速度离心5min,静置分层 ，上层为乙酸乙酯层；取0.4mL乙酸乙酯层溶液于具 塞试管中，置于70℃水浴挥发至干；加1mL水溶解残 留物
@ 操作步骤 3.试剂空白：取1.0mL水于离心管中，后续处理 同样品处理。 4.马尿酸和甲基马尿酸标准溶液的配制：取4支 离心管，标号为0-3，按表1，向各管中依次加入 标准溶液和水。 表1马尿酸和甲基马尿酸标准管的配制 管号 0 1 2 3 1mg/mL标准溶液(mL) 0.000.15 0.200.25 水(mL) 1.00 0.85 0.80 0.75 马尿酸含量(mg) 0.00 0.15 0.2 0.25 2-甲基马尿酸含量(mg) 0.000.15 0.20 0.25 3-甲基马尿酸含量(mg) 0.00 0.15 0.20 0.25 4-甲基马尿酸含量(mg) 0.00 0.15 0.20 0.25
@ 操作步骤 5.仪器操作条件 ·色谱柱：150mm,内径4.6mm,不锈钢 柱。 ·柱填料：C1键合多孔硅胶，5um; ·柱温：室温。 ·流动相：甲醇+水+冰乙酸=20+80+0.01： ·流速：1mL/min。 ·紫外检测器：波长：254nm