新乡医学院实验课教案首页 课程名称 《食品理化检验》 授课教师 高霞 授课题目 食品中总抗坏血酸的测定一一分子荧光法 授课对象 2012级本科卫生检验专业 1、讲解实验原理及方法 30min 2、样品前处理、工作曲线的绘制及样品的测定 150min 时间分配 3、实验结果的分析、小结 20min 1、掌握分子荧光法测定食品中抗坏血酸的基本原理和方法。 课时目标 2、熟悉样品中总抗坏血酸的提取操作步骤。 3、了解食品中抗坏血酸测定的意义。 授课重点 1、分子荧光法测定总抗坏血酸的原理 2、样品中总抗坏血酸测定的样品前处理方法 授课难点 1、样品中总抗坏血酸测定的样品前处理方法 2、样品的制备 授课形式 小班实验课教学 授课方法 讲授结合示教、练习 参考文献 《食品理化检验》，黎源倩主编，人民卫生出版社，第2版(2015.1) 《卫生检验检疫实验教程：卫生理化检验分册》，高蓉主编 样品处理为何使用偏磷酸-乙酸溶液，这两种试剂的作用是什么？ 思考题 教研室主任（签字) 课程负责人（签字） 教研室主任 及课程负责 人签字 年 日 年 月 日
食品中总抗坏血酸的测定 -分子荧光法 抗坏血酸又称维生素C,是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用， 广泛存在于植物组织中，如新鲜的水果、蔬菜等。抗坏血酸的毒性很 小，但摄入过多可能产生一些明显的毒性或轻微的不良反应。每天摄 入10mg的抗坏血酸可以预防坏血病发生，国际组织和多个国家对抗 抗坏血酸的推荐摄入量为45~110mg/d,中国营养学会2002年推荐的 成年人抗坏血酸摄入量为100mg/d. 【实验目的】 1、掌握分子荧光法测定食品中抗坏血酸的基本原理和方法。 2、熟悉样品中总抗坏血酸的提取操作步骤。 3、了解食品中抗坏血酸测定的意义。 【实验原理】 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸后，与邻苯 二胺反应生成有荧光的喹喔啉衍生物，其荧光强度与脱氢型抗坏血酸 的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢型抗坏 血酸的总量。 活性炭氧化作用： 将活性炭置于(1：9)的盐酸中加热回流1~2小时，过滤，用水洗 至滤液中无铁离子为止，置于110-120℃烘箱中干燥。这样，活性 炭形成多孔微晶结构，具有大的比表面积。大的比表面积吸附氧，遇 还原型抗坏血酸时，在活性炭表面发生氧化-还原反应，使抗坏血酸
转换为脱氢型抗坏血酸。 方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗血酸的测定。 【仪器与试剂】 仪器 安捷伦荧光分光光度计：组织捣碎机 试剂 偏磷酸-乙酸溶液；硫酸溶液：偏磷酸-乙酸-硫酸溶液；乙酸钠溶 液：硼酸-乙酸钠溶液；邻苯二胺溶液，抗坏血酸标液，百里酚蓝指 示剂(pH4为蓝色)。 【实验步骤】 样品前处理 (1)样品提取 称取100g新鲜样品，加100g偏磷酸-乙酸溶液打成匀浆.称取20g 匀浆于100ml容量瓶中。 加1滴百里酚蓝指示剂。若成红色，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至刻 度，若成黄色或蓝色，用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释至刻度(pH=1.2)。 混匀，过滤，滤液备用。 (2)氧化处理 取样品滤液、标准应用液各50mL于两只100mL具塞三角瓶中， 分别加入1g活化后活性炭，用力振摇lmin,过滤，收集滤液，得样 品氧化液和标准氧化液。 (3)制备试液、标液及其空白
各取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中，分别标记“标 准”、“标准空白”：各取10mL样品氧化液于两个100mL容量瓶中， 分别标记“样品”、“样品空白”。 于标准空白及样品空白中各加入5mL硼酸-乙酸钠溶液，摇动 15min,用水稀释至刻度，4℃冰箱中放置2-3小时，取出备用。 于样品及标准溶液中各加入500gL乙酸钠溶液5mL,用水稀释 至刻度，备用。 硼酸的作用：食物中的丙酮酸，也与邻苯二胺反应生成一种荧光 物质，干扰测定。加入硼酸后，硼酸与脱氢型抗坏血酸发生螯合 作用生成的硼酸脱氢型螯合物不与邻苯二胺作用。丙酮酸则不会 和硼酸发生此作用，仍可以与邻苯二胺生成荧光物质。因此加入 硼酸-乙酸钠后溶液的荧光强度为丙酮酸与邻苯二胺生成的荧光 物质产生的，为总抗血酸测定的背景值。 样品测定 取上述标准溶液0.50,1.00,1.50,2.00于10mL比色管中，再用水补充 至2.00mL: 另取标准空白溶液、样品空白溶液及样品溶液各2.00mL,分别置 于10mL比色管中： 向各管中迅速加入5.00mL邻苯二胺溶液，振摇混合，在室温下反 应35min 以标准系列中浓度最大管在安捷伦荧光分光光度计上找最大激发 波长和最大发射波长。在最大发射波长下测定各管的荧光强度。以浓
度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，求线性拟合方程， 计算样品中总抗坏血酸的浓度。 【数据处理】 从线性回归方程中求得的总抗坏血酸的浓度代入下述公式，计算 样品中抗坏血酸的总含量 X=(pxV)xFx 100 m 1000 X—样品中抗坏血酸的总含量，mg100g p一由标准曲线得到的测定试液的浓度，gmL V—荧光反应中测定试液的体积，ugmL m—样品的质量，g 下一试样溶液的稀释倍数，g 计算结果保留到小数点后一位。 【注意事项】 1.4%偏磷酸溶液和2%的草酸溶液均有抑制抗坏血酸氧化酶的作用 防止抗坏血酸被破坏，影响测定结果的准确性。 2抗坏血酸易光解，反应在暗处进行。 3.活性炭对抗坏血酸的氧化作用是基于其表面表面吸附的氧进行界 面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量过高，对 抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。 4荧光测定影响因素多，为减小误差，标准管和样品管应同时测定。 【思考题】