新乡医学院教案首页 课程名称 《食品理化检验》 授课题目 蛋白质的测定 授课对象 卫检专业学生 1、复习相关理论课内容 2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理及方法 时间分配 学生实验 1、 掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。 课时目标 2、热悉蛋白质换算系数及在蛋白质含量计算中的应用。 3、了解蛋白质的消化。 授课重点 凯氏定氮法的测定原理 授课难点 凯氏定氮法测定蛋白质的方法 授课形式 小班实验误教学 授课方法 敖授结合示教、练习 食品理化检验，黎源倩，叶蔚云主编.人民卫生出版社 参考文献 卫生检验检疫实验教程：卫生理化检验分册.高蓉主编.人民卫生出 版社 思考题 本实验中加入硫酸、硫酸钾和疏酸铜的作用是什么？ 教研室主任及 教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 课程负责人签 字 年月日 年月日
教紧续页 教学组织与 讲义内容 教学安排 凯氏定氮法测蛋白质含量 一、原理 学生重立零推阳容 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与疏酸和催化剂一同加热消化，使蛋 白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼 酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即 为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下，硝化生成(NH4》 2S04 反应式为： 2NH2+H2S04+2H=(NH4)2S04(其中CuS04做催化剂) 2.在凯氏定氨器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3,收集于H3BO3浴 液中 反应式为： (NH4)2S04+2NaOH=2NH3+2H20+Na2S04 2NHB+4H3B03=NH42B407+5H20 3.用已知浓度的H2SO4(或HC)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量 算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量 反应式为： NH4)2B407+H2S04+5H20=(NH4)2S04+4H3B03 NH4)2B407+2HCI+5H20=2NH4CI+4H3B03 所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。 硫酸铜。 硫酸钾。 硫酸。 2%硼酸溶液。 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇 液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶 液临用时混合
40%氢氧化钠溶液 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。 仪器 凯氏定氨法仪器 1.安全管 2.导管 3汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶 转合注喜韦项给学 二、操作方法 生讲斜桥作步骤， 1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或25g半固体样品或吸取 将童走南容提醒学 10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶 中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏 斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化， 泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透 明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100m 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀 备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白
试验。 2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约23处加甲基红指示剂 数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器 控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 3、向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管 的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml 水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml40%氢 氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖 塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始燕馏，蒸气通入反应 室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端 离开液皿，再慕馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶， 以O.01N硫酸或O,.O1N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。 同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。 计算 X((V1-V2)*N*0.014)m*(10/100))*F*100 X:样品中蛋白质的百分含量，g: V1:样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，m: V2:试剂空白消耗疏酸或盐酸标准溶液的体积，m N:硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度： 0.014:1N疏酸或盐酸标准溶液1ml相当于氨克数： m:样品的质量（体积），g(ml): F:氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氨含量一般为15~17.6%，找 16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为 6.24,花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大 麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。 三、注意事项 (1)样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌 均匀。 (2)样品放入定氯瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以 免被检样消化不完全，结果偏低
(3)硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氯瓶放冷后，慢慢加入30%过氧 化氢(H202)2-3ml,促使氧化。 (4)在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯 氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。 (5)如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾， 而不与氨作用。因此，当疏酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增 加疏酸的量。 (6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，疏酸铜在蒸 馏时作碱性反应的指示剂。 (7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液 中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 (8)氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性 (9)吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴 定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓 度，其余均相同。 (10)以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并 不严格，亦可免去用移液管，樑作比较简便。 (11)向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱 与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀 有时铜离子与氨作用，生成深1蓝色的结合物[CuNH34]24 (12)这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在 被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量