第十四章特异性抗体的制备技术 Chapter 14 Preparation of Specific Antibody 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：特异性抗体的类型、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理：熟悉：常用颗粒 性和蛋白质抗原制备的方法、多克隆抗体制备的的影响因素，常用佐剂种类：了解：抗血清 的鉴定，基因工程抗体的类型。 二、教学内容 1.常见免疫原的种类和制备及佐剂。 2.免疫血清的制备，抗血清的鉴定与保存。 3。单克隆抗体制备技术。 4.基因工程抗体技术。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A.102/ml B.10/ml C.105/ml D.10°/ml E.10%/ml 2.细菌鞭毛免疫原常规的制备方法 A.0.5%甲醛处理 B.100℃加温2h处理 C.1%氯化钙处理 D.75%乙醇 处理 E.2%氯肪处理 3.细菌的菌体免疫原常规的制备方法 A.75%乙醇处理 B.100℃加温2h处理 C.0.5%甲醛处理 D.1% 氯化钙处理 E.2%氯肪处理 4.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 5.制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体
第十四章 特异性抗体的制备技术 Chapter 14 Preparation of Specific Antibody 第一部分 教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：特异性抗体的类型、杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理；熟悉：常用颗粒 性和蛋白质抗原制备的方法、多克隆抗体制备的的影响因素，常用佐剂种类；了解：抗血清 的鉴定，基因工程抗体的类型。 二、教学内容 1．常见免疫原的种类和制备及佐剂。 2．免疫血清的制备，抗血清的鉴定与保存。 3．单克隆抗体制备技术。 4．基因工程抗体技术。 第二部分 测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A 型题） 1.配制绵羊红细胞免疫原一般细胞浓度为 A.102 /ml B.104 /ml C.105 /ml D.106 /ml E.108 /ml 2．细菌鞭毛免疫原常规的制备方法 A．0.5%甲醛处理 B．100℃加温 2h 处理 C．1%氯化钙处理 D. 75%乙醇 处理 E.2%氯肪处理 3. 细菌的菌体免疫原常规的制备方法 A. 75%乙醇处理 B. 100℃加温 2h 处理 C. 0.5%甲醛处理 D. 1% 氯化钙处理 E.2%氯肪处理 4.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法 A. 盐析法 B. 凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E. 免疫电泳法 5.制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体
A.免疫球蛋白 B.人甲状腺球蛋白 C,人血清白蛋白 D.牛血清白蛋白 E.葡萄球菌A蛋白 6.蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫 A.710天 B.1020天 C.2030天 D.3060天 E.三个月 7.鉴定抗体的效价，最好采用下列哪一种方法 A.间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法 D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 8.纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 9.根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 10。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A.亲和层析法 B。凝胶过滤法 C。离子交换层析法 D.超速离心法 E。 盐析法 11.完全佐剂的组成 A.液体石蜡+羊毛脂 B.羊毛脂+氢氧化铝 C.液体石蜡+卡介苗+氢氧化 铝 D.卡介苗+氢氧化铝+羊毛脂 E.卡介苗+液体石蜡+羊毛脂 12.要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到 A.10个以上 B.15个以上 C.20个以上 D.50个以上 E.100个以上 13.颗粒性抗原免疫接种方法一般采用 A.淋巴结注射 B.静脉注射 C.皮内注射 D.皮下注射 E.肌 肉内注射 14。免疫小鼠采血通常采用 A.心脏采血或断尾法 B.颈动脉放血或断尾法 C.颈静脉或摘除眼球 采血 D.摘除眼球或断尾法 E.耳静脉采血或摘除眼球
A. 免疫球蛋白 B. 人甲状腺球蛋白 C .人血清白蛋白 D. 牛血清白蛋白 E. 葡萄球菌 A 蛋白 6.蛋白质抗原首次免疫接种后，最好间隔多长时间再进行第二次免疫 A . 7~10 天 B. 10~20 天 C. 20~30 天 D. 30~60 天 E. 三个月 7.鉴定抗体的效价，最好采用下列哪一种方法 A.间接凝集试验 B.单向免疫扩散法 C.双向免疫扩散法 D.免疫亲和层析法 E.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 8.纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C. 离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 9.根据抗原分子所带电荷不同进行分离纯化的方法称为 A.盐析法 B.凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.免疫亲和层析法 E.免疫电泳法 10。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A。亲和层析法 B。凝胶过滤法 C。离子交换层析法 D。超速离心法 E。 盐析法 11.完全佐剂的组成 A.液体石蜡+羊毛脂 B.羊毛脂+氢氧化铝 C. 液体石蜡+卡介苗+氢氧化 铝 D.卡介苗+氢氧化铝 +羊毛脂 E. 卡介苗+液体石蜡+羊毛脂 12.要使半抗原与载体结合具有免疫原性、半抗原分子的数目数至少要达到 A.10 个以上 B.15 个以上 C.20 个以上 D.50 个以上 E.100 个以上 13．颗粒性抗原免疫接种方法一般采用 A．淋巴结注射 B．静脉注射 C．皮内注射 D．皮下注射 E．肌 肉内注射 14。免疫小鼠采血通常采用 A．心脏采血或断尾法 B．颈动脉放血或断尾法 C．颈静脉或摘除眼球 采血 D．摘除眼球或断尾法 E．耳静脉采血或摘除眼球
15.较长时间(45年)保存抗体，通常采用 A.4℃保存 B.-10℃保存 C.-20℃保存 D.-30℃保存 E.真 空干燥保存 16.在HAT选择培养基中可长期存活者是 A,细胞多聚体 B.融合的脾细胞与瘤细胞 C.融合的瘤细胞与瘤细胞 D.未融合的瘤细胞 E.未融合的脾细胞 17。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A。亲和层析法 B.凝胶过滤法 C。离子交换层析法 D。超速离心法 E。 盐析法 (二)多项选择题(X型题) 1,从组织细胞中提纯某可溶性抗原，一般需经过下列哪些步骤 A.破碎细胞 B.选择性沉淀 C.亲和层析 D.与载体偶联 E.纯度鉴定 2.可用于破碎组织细胞制备可溶性抗原的方法有 A.超声破碎法 B.冻融法 C.超速离心法 D.酶处理法 E.表面活性剂处理法 3。提取蛋白质免疫原所用的沉淀法包括 A.盐析法 B.高分子聚合物沉淀法 C.有机溶剂沉淀法 D.核酸沉淀法 E.醋酸沉淀法 4.提取蛋白质免疫原的技术有 A.选择性沉淀 B.超速离心 C.凝胶层析 D.离子交换层析 E.亲和层析 5.免疫血清制备的过程 A.选择免疫动物 B.免疫方法 C.动物采血 D.免疫血清的纯 化 E.抗血清的鉴定 6.单克隆抗体纯化的方法
15．较长时间(4~5 年)保存抗体，通常采用 A．4℃保存 B．-10℃保存 C．-20℃保存 D．-30℃保存 E．真 空干燥保存 16．在 HAT 选择培养基中可长期存活者是 A．细胞多聚体 B．融合的脾细胞与瘤细胞 C．融合的瘤细胞与瘤细胞 D．未融合的瘤细胞 E.未融合的脾细胞 17。单克隆抗体目前效果较好的纯化方法 A。亲和层析法 B。凝胶过滤法 C。离子交换层析法 D。超速离心法 E。 盐析法 （二）多项选择题（X 型题） 1．从组织细胞中提纯某可溶性抗原，一般需经过下列哪些步骤 A. 破碎细胞 B. 选择性沉淀 C. 亲和层析 D. 与载体偶联 E. 纯度鉴定 2．可用于破碎组织细胞制备可溶性抗原的方法有 A. 超声破碎法 B. 冻融法 C. 超速离心法 D.酶处理法 E. 表面活性剂处理法 3．提取蛋白质免疫原所用的沉淀法包括 A.盐析法 B.高分子聚合物沉淀法 C.有机溶剂沉淀法 D.核酸沉淀法 E.醋酸沉淀法 4．提取蛋白质免疫原的技术有 A.选择性沉淀 B.超速离心 C.凝胶层析 D.离子交换层析 E.亲和层析 5．免疫血清制备的过程 A．选择免疫动物 B．免疫方法 C．动物采血 D．免疫血清的纯 化 E．抗血清的鉴定 6．单克隆抗体纯化的方法
A。亲和层析法 B。凝胶过滤法 C.离子交换层析法 D.超速离心法 E.盐析法 7.单克隆抗体制备的流程 A.抗原的免疫和细胞融合 B.抗体初筛与克隆化 C.杂交瘤细胞的冻存 与复苏 D.单克隆抗体的批量生产 E.单克隆抗体的纯化与鉴定 8。用于抗血清的免疫球蛋白片段的主要制备方法 A.分离非共价键法 B.分离共价键法 C.溴化氰裂解法 D.酶裂解 法 E.乙醇裂解法 9.目前认为佐剂增强免疫应答的机理 A.增加抗原的表面积和改变抗原构型 B.佐剂与抗原结合改变抗原的物理性 状 C.增强巨噬细胞的吞噬作用 D.佐剂与抗原结后直接激活NK细胞发挥效应 E.直接激活B细胞产生抗体 二、填空题 1,·根据抗体制备的技术方法不同进行区分，人工制备的抗体可分为 和 三大类型。 2。抗血清鉴定的主要内容包括」 和一 等四个方面。 3.制备特异性免疫血清时，常用」 和 两种方法去除杂抗体。 4.HAT培养基中三种关键成分是 和 5。单克隆抗体的批量生产方法主要有两种 和 三、名词解释 1.单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb) 2.佐剂(ad juvant) 3.基因工程抗体(genetic engineering antibody) 4。嵌合抗体(chimeric antibody) 5。改形抗体(reshaped antibody,RAb)
A。亲和层析法 B．凝胶过滤法 C．离子交换层析法 D．超速离心法 E．盐析法 7．单克隆抗体制备的流程 A．抗原的免疫和细胞融合 B．抗体初筛与克隆化 C．杂交瘤细胞的冻存 与复苏 D．单克隆抗体的批量生产 E．单克隆抗体的纯化与鉴定 8．用于抗血清的免疫球蛋白片段的主要制备方法 A．分离非共价键法 B．分离共价键法 C．溴化氰裂解法 D．酶裂解 法 E．乙醇裂解法 9．目前认为佐剂增强免疫应答的机理 A.增加抗原的表面积和改变抗原构型 B.佐剂与抗原结合改变抗原的物理性 状 C.增强巨噬细胞的吞噬作用 D.佐剂与抗原结后直接激活 NK 细胞发挥效应 E.直接激活 B 细胞产生抗体 二、填空题 1．.根据抗体制备的技术方法不同进行区分，人工制备的抗体可分为＿＿＿＿＿＿ ＿、＿＿＿＿＿＿ 和 ＿＿＿＿＿＿ 三大类型。 2．抗血清鉴定的主要内容包括＿＿＿＿＿＿＿ 、＿＿＿＿＿＿＿ 、＿＿＿＿＿＿＿ 和 ＿ ＿＿＿＿＿＿ 等四个方面。 3．制备特异性免疫血清时，常用＿＿＿＿＿＿ 和 ＿＿＿＿＿＿ 两种方法去除杂抗体。 4．HAT 培养基中三种关键成分是＿＿＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿。 5。单克隆抗体的批量生产方法主要有两种 ＿＿＿＿＿＿＿ 和 ＿＿＿＿＿＿＿ 。 三 、 名词解释 1．单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb) 2．佐剂(adjuvant) 3．基因工程抗体(genetic engineering antibody) 4。嵌合抗体（chimeric antibody） 5。改形抗体（reshaped antibody，RAb）
6。双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb) 四、问答题 1.简述单克隆抗体制备技术的主要步骤。 2.试述免疫血清应如何进行纯化。 3.叙述杂交瘤技术的基本原理 第三部分参考答案与题解 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.D 2.A 3.B 4.A 5.D 6.B7.C8。D 9.C10.A 11.E 12.C13。B 14.D 15.E16. B (二)多项选择题(X型题) 1.ABCE 2.ABDE 3.ABCD 4.ABCDE 5.ABCDE 6.ABCE 7.ABCDE 8.ABCD 9.ABC 二、填空题 5.多克隆抗体、 单克隆抗体、 基因工程抗体 2.抗体效价、抗体特异性、 抗体纯度、 抗体亲和力 3.亲和层析法、吸附法 4.次黄嘌呤、 氨基蝶呤、 胸腺嘧啶 5.小鼠体内诱生法、 体外增殖培养法 三、名词解释 1.单克隆抗体：是指仅识别单一抗原表位的B细胞杂交瘤产生的同源抗体，具有特异 性强、效价高、生物活性单一、理化性状高度均一等特点。 2.佐剂：是指先于抗原或与抗原一起注入机体，能够增强机体对该抗原的免疫应答或 改变免疫应答类型的物质
6。双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb） 四、问答题 1．简述单克隆抗体制备技术的主要步骤。 2．试述免疫血清应如何进行纯化。 3．叙述杂交瘤技术的基本原理 第三部分 参考答案与题解 一、选择题 （一）单项选择题（A 型题） 1.D 2.A 3.B 4．A 5．D 6．B 7．C 8。D 9．C 10．A 11.E 12．C 13。B 14. D 15．E 16. B （二）多项选择题（X 型题） 1．ABCE 2．ABDE 3.ABCD 4.ABCDE 5．ABCDE 6．ABCE 7．ABCDE 8．ABCD 9.ABC 二、填空题 5.多克隆抗体、 单克隆抗体、 基因工程抗体 2.抗体效价、 抗体特异性、 抗体纯度、 抗体亲和力 3.亲和层析法、 吸附法 4.次黃嘌呤、 氨基蝶呤、 胸腺嘧啶 5.小鼠体内诱生法、 体外增殖培养法 三 、 名词解释 1．单克隆抗体：是指仅识别单一抗原表位的 B 细胞杂交瘤产生的同源抗体，具有特异 性强、效价高、生物活性单一、理化性状高度均一等特点。 2．佐剂：是指先于抗原或与抗原一起注入机体，能够增强机体对该抗原的免疫应答或 改变免疫应答类型的物质
3.基因工程抗体：是指应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要 进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，主要包括人源化抗体、小分子 抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等类型。 4,嵌合抗体：又称人-鼠嵌合抗体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单抗功能性V区基因， 经基因重组与人抗体C区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染宿主 细胞，表达人-鼠嵌合抗体分子。嵌合抗体保留了单抗对抗原的特异亲和性，又含有人抗体 C区的成分及其功能。 5.改形抗体：是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取 代鼠源单抗CDR以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人 源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。 6,双特异性抗体（又称双功能抗体）：它不同于天然抗体，其两个抗原结合部位具有不 同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。 四、问答题 1.单克隆抗体是应用B细胞杂交瘤技术进行制备的，其主要操作步骤包括抗原免疫、 亲本细胞的选择和制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和克隆化、杂交瘤细胞体内接种或体 外增量培养、单克隆抗体的纯化与鉴定。 2.免疫血清的纯化主要是指提纯免疫血清中的IgG并去除无关的杂抗体。提纯 IgG类抗体的方法有：硫酸胺盐析法粗提、离子交换层析法和亲和层析法，采用亲 和层析法提取IgG时，可使用纯化抗原或葡萄球菌蛋白A交联Sepharose4B制成层 析柱。另外，还可通过吸附法获得单价特异性抗血清。方法是将不含特异性抗原的 杂抗原与戊二醛等双功能试剂混合制成固相吸附剂，以吸附免疫血清中的杂抗体， 或将杂抗原交联于Sepharose4B上，通过亲和层析去除杂抗体。 3。杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞 和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞 的特性，即既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖，经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的 抗体即为单克隆抗体。 (陈敏)
3．基因工程抗体：是指应用 DNA 重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要 进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，主要包括人源化抗体、小分子 抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等类型。 4．嵌合抗体：又称人-鼠嵌合抗体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单抗功能性 V 区基因， 经基因重组与人抗体 C 区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染宿主 细胞，表达人-鼠嵌合抗体分子。嵌合抗体保留了单抗对抗原的特异亲和性，又含有人抗体 C 区的成分及其功能。 5．改形抗体：是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取 代鼠源单抗 CDR 以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人 源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。 6．双特异性抗体（又称双功能抗体）：它不同于天然抗体，其两个抗原结合部位具有不 同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。 四、问答题 1．单克隆抗体是应用 B 细胞杂交瘤技术进行制备的，其主要操作步骤包括抗原免疫、 亲本细胞的选择和制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和克隆化、杂交瘤细胞体内接种或体 外增量培养、单克隆抗体的纯化与鉴定。 2．免疫血清的纯化主要是指提纯免疫血清中的 IgG 并去除无关的杂抗体。提纯 IgG 类抗体的方法有：硫酸胺盐析法粗提、离子交换层析法和亲和层析法，采用亲 和层析法提取 IgG 时，可使用纯化抗原或葡萄球菌蛋白 A 交联 Sepharose 4B 制成层 析柱。另外，还可通过吸附法获得单价特异性抗血清。方法是将不含特异性抗原的 杂抗原与戊二醛等双功能试剂混合制成固相吸附剂，以吸附免疫血清中的杂抗体， 或将杂抗原交联于 Sepharose 4B 上，通过亲和层析去除杂抗体。 3．杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏 B 细胞 和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为 B 细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞 的特性，即既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖，经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的 抗体即为单克隆抗体。 (陈 敏)