第二十三章流式细胞术 Chapter 23 Flow Cytometry 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：流式细胞仪分析和分选原理、数据的显示与分析，流式细胞仪免疫分析：熟悉： 流式细胞仪在免疫学中的应用：了解：流式细胞仪的组成及在免疫分析的质量控制。 二、教学内容 1。流式细胞仪的原理：流式细胞仪工作原理，细胞散射光信号测定，细胞荧光信号测 定，细胞分选的原理 2。数据的显示与分析：参数，数据显示方式。 3。流式细胞仪免疫分析：免疫检测样本的制备，常用的荧光染料与标记染色，流式细 胞仪免疫分析的质量控制。 4.流式细胞术在免疫学中的应用：淋巴细胞及其亚群的测定，淋巴细胞功能测定，白 血病细胞免疫分型，肿瘤耐药基因分析，AIDS病程分析，自身免疫性疾病相关HLA分析。 第二部分测试题 一、选择题 （一)单项选择题(A型题) 1.流式细胞仪的单参数数据显示方式是 A.二维的散点图 B.等高线轮廓图 C.分布直方图 D.密度图 E.三维立体显示 2.关于前向散射光信号，正确的是 A.反映细胞质中的颗粒成分 B.可排除各种碎片对被检细胞的干扰 C.用于区分淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等 D.细胞调亡时，前向散射光信号变强 E.反映细胞内部结构的形态学改变
第二十三章 流式细胞术 Chapter 23 Flow Cytometry 第一部分 教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：流式细胞仪分析和分选原理、数据的显示与分析，流式细胞仪免疫分析；熟悉： 流式细胞仪在免疫学中的应用；了解：流式细胞仪的组成及在免疫分析的质量控制。 二、教学内容 1。流式细胞仪的原理：流式细胞仪工作原理，细胞散射光信号测定，细胞荧光信号测 定，细胞分选的原理 2。数据的显示与分析：参数，数据显示方式。 3。流式细胞仪免疫分析：免疫检测样本的制备，常用的荧光染料与标记染色，流式细 胞仪免疫分析的质量控制。 4．流式细胞术在免疫学中的应用：淋巴细胞及其亚群的测定，淋巴细胞功能测定，白 血病细胞免疫分型，肿瘤耐药基因分析，AIDS 病程分析，自身免疫性疾病相关 HLA 分析。 第二部分 测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A 型题） 1.流式细胞仪的单参数数据显示方式是 A.二维的散点图 B.等高线轮廓图 C.分布直方图 D.密度图 E.三维立体显示 2.关于前向散射光信号，正确的是 A.反映细胞质中的颗粒成分 B.可排除各种碎片对被检细胞的干扰 C.用于区分淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等 D.细胞凋亡时，前向散射光信号变强 E.反映细胞内部结构的形态学改变
3.关于流式细胞仪，错误的叙述是 A.可同时测量同一细胞的多个参数 B.采用List Mode数据贮存方式 C.标准荧光微球和戊二醛固定的鸡红细胞是常用的质控参考标准 D.只有一种数据显示方式 E.1~2min内就能完成细胞大群体的定量分析 4.分离外周血单个核细胞的常用方法是 A.ELISA B.E花环试验 C.尼龙毛法 D.流式细胞术 E.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 （二)多项选择题(X型题) 1.流式细胞仪的特点包括 A快速 B.单细胞流 C.单细胞检测 D.定量 E.单细胞照明 2.流式细胞仪常用的荧光染料有 A.异硫氰酸荧光素 B.藻红蛋白 C.PeCy5 D.PeCy7 E.ECD 3.关于流式细胞仪的荧光标记染色，正确的是 A.避免使用固定剂 B.减少离心 C.减少洗涤次数
3.关于流式细胞仪，错误的叙述是 A.可同时测量同一细胞的多个参数 B.采用 List Mode 数据贮存方式 C.标准荧光微球和戊二醛固定的鸡红细胞是常用的质控参考标准 D.只有一种数据显示方式 E.1～2min 内就能完成细胞大群体的定量分析 4.分离外周血单个核细胞的常用方法是 A.ELISA B.E 花环试验 C.尼龙毛法 D.流式细胞术 E.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 （二）多项选择题（X 型题） 1.流式细胞仪的特点包括 A.快速 B.单细胞流 C.单细胞检测 D.定量 E.单细胞照明 2.流式细胞仪常用的荧光染料有 A.异硫氰酸荧光素 B.藻红蛋白 C.PeCy5 D.PeCy7 E.ECD 3.关于流式细胞仪的荧光标记染色，正确的是 A.避免使用固定剂 B.减少离心 C.减少洗涤次数
D.必须在细胞悬液中进行 E.一般采用间接荧光免疫标记方法 4.流式细胞仪的双参数数据显示方式有 A.二维散点图 B.三维立体图 C.线性分布直方图 D.对数分布直方图 E.等高线轮廓图 5.流式细胞术可用于 A.检测血清细胞因子水平 B.检测凋亡细胞 C.白血病的免疫学分型 D.检测LA E.T细胞检测及其亚群分类 6.检测细胞可采用 A.Cr放法 B.流式细胞术 C.TUNEL法 D.3H-TdR掺入法 E.MTT法 7.用于检测T细胞免疫功能的试验是 A.淋巴细胞转化试验 B.细胞毒试验 C.流式细胞术 D.溶血空斑试验 E.结核菌素皮肤试验 8.从T细胞中分离CD4T细胞可用 A.磁珠分离法 B.流式细胞术 C.ELISPOT
D.必须在细胞悬液中进行 E.一般采用间接荧光免疫标记方法 4.流式细胞仪的双参数数据显示方式有 A.二维散点图 B.三维立体图 C.线性分布直方图 D.对数分布直方图 E.等高线轮廓图 5.流式细胞术可用于 A.检测血清细胞因子水平 B.检测凋亡细胞 C.白血病的免疫学分型 D.检测 HLA E.T 细胞检测及其亚群分类 6.检测细胞可采用 A.51Cr 放法 B.流式细胞术 C.TUNEL 法 D.3H-TdR 掺入法 E.MTT 法 7.用于检测 T 细胞免疫功能的试验是 A.淋巴细胞转化试验 B.细胞毒试验 C.流式细胞术 D.溶血空斑试验 E.结核菌素皮肤试验 8.从 T 细胞中分离 CD4+ T 细胞可用 A.磁珠分离法 B.流式细胞术 C.ELISPOT
D.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 E.TUNEL法 9.检测T细胞亚群可采用的方法是 A.间接凝集试验 B.MTT法 C.间接荧光免疫法 D.流式细胞术 E.沉淀试验 10.流式细胞仪免疫分析的质量控制 A.仪器的质控 B.免疫荧光对照 C.双荧光或多荧光分析中荧光色的 标定 D.试剂标准化 E.操作标准化 二、填空题 1.流式细胞仪的组成包括 和 三部分。 2.流式细胞仪的散射光参数包括 和 。其中 信号反映细胞 的大小，常用于排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰： 信号反映细胞内部结构的 形态学信息，常用于区分外周血样品中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。 3. 和 组成细胞双信号参数散点图，是流式细胞分析中最常用的测 量和显示细胞的方式。 4.能对免疫细胞和其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术是 使用的仪器 主要试剂是 三、名词解释 1.流式细胞术(flow cytometry,FCM) 2.细胞分选(cel1 sorting) 3.List Mode 4.荧光补偿技术(fluorescent compensation) 四、问答题
D.聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法 E.TUNEL 法 9.检测 T 细胞亚群可采用的方法是 A.间接凝集试验 B.MTT 法 C.间接荧光免疫法 D.流式细胞术 E.沉淀试验 10. 流式细胞仪免疫分析的质量控制 A.仪器的质控 B. 免疫荧光对照 C.双荧光或多荧光分析中荧光色的 标定 D.试剂标准化 E.操作标准化 二、填空题 1.流式细胞仪的组成包括_________、_________和_________三部分。 2.流式细胞仪的散射光参数包括 _________和_________。其中_________信号反映细胞 的大小，常用于排除样品中各种碎片对被测细胞的干扰；________信号反映细胞内部结构的 形态学信息，常用于区分外周血样品中的淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞。 3. _________和_________组成细胞双信号参数散点图，是流式细胞分析中最常用的测 量和显示细胞的方式。 4.能对免疫细胞和其他细胞进行快速准确鉴定和分类的技术是_________，使用的仪器 是_________，主要试剂是_________。 三、名词解释 1.流式细胞术（flow cytometry，FCM） 2.细胞分选(cell sorting) 3.List Mode 4.荧光补偿技术（fluorescent compensation） 四、问答题
1.简述流式细胞仪的工作原理。 2.论述流式细胞术在免疫学中的应用。 3.简述细胞分选的原理。 第三部分参考答案与题解 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.C2.B3.D4.E (二)多项选择题(X型题) 1.ABCDE 2.ABCDE 3.ABCD 4.ABE 5.BCDE 6.BC 7.ABCDE 8.AB 9.CD 10.ABCDE 二、填空题 1.流动室与液流驱动系统 激发光与光束成形系统 细胞信号检测与分析处理系 统 2.FS SS FS SS 3.FS SS 4.流式细胞术 流式细胞仪 荧光标记的单克隆抗体 三、名词解释 1.流式细胞术：是指借助流式细胞仪，精确、快速地对生物细胞的理化特性和生物学特 性进行多参数定量分析，并对特定细胞群体分选的新技术。 2.细胞分选：是指从细胞群体中将选定的细胞分离出来。 3.List Mode方式：是指用表格将每一个被测细胞的众多原始数据全部记录下来，形 成数据文件。 4.荧光补偿技术：是指利用己知标准样品或根据细胞样品的生物学意义，合理设置各 荧光信号之间的相互补偿值
1.简述流式细胞仪的工作原理。 2.论述流式细胞术在免疫学中的应用。 3.简述细胞分选的原理。 第三部分参考答案与题解 一、选择题 （一）单项选择题（A 型题） 1.C 2.B 3.D 4.E （二）多项选择题（X 型题） 1.ABCDE 2.ABCDE 3.ABCD 4.ABE 5.BCDE 6.BC 7.ABCDE 8.AB 9.CD 10.ABCDE 二、填空题 1.流动室与液流驱动系统 激发光与光束成形系统 细胞信号检测与分析处理系 统 2.FS SS FS SS 3.FS SS 4.流式细胞术 流式细胞仪 荧光标记的单克隆抗体 三、名词解释 1.流式细胞术：是指借助流式细胞仪，精确、快速地对生物细胞的理化特性和生物学特 性进行多参数定量分析，并对特定细胞群体分选的新技术。 2. 细胞分选：是指从细胞群体中将选定的细胞分离出来。 3. List Mode 方式：是指用表格将每一个被测细胞的众多原始数据全部记录下来，形 成数据文件。 4. 荧光补偿技术：是指利用已知标准样品或根据细胞样品的生物学意义，合理设置各 荧光信号之间的相互补偿值
四、问答题 1.流式细胞仪是一种在计算机技术支持下高度自动化的显微荧光脉冲分光光度仪，可分 为三个部分：(1)细胞流动室及其液流驱动系统：细胞样品和包裹在外的鞘液在气体正压 的驱动下一起流经流动室，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个以相同的速度、相同的轨 迹通过检测区，此为流式细胞仪的单细胞流技术：(2)激发光及其光束成形系统：流式细 胞仪的激发光大多采用氩离子气体激光器，也可采用半导体激光器。仪器中一般都采用两块 相互垂直放置的柱面透镜组成光束成形系统，对激光束进行适当的聚焦，形成截面为椭圆形 的照射光斑即检测区。椭圆形光斑的检测区能保证样品中细胞是一个一个分别受到光照，并 且每一受检细胞都受到一致的光照激发，此为流式细胞仪中的单细胞照明技术：(3)细胞 信号检测与分析处理系统：细胞受到激发光照射时，产生散射光和荧光信号。光电倍增管及 其电子线路将每一细胞的光信号转换为相应的电信号，后者再通过模数转换器(ADC)量化 为数字信号，由计算机采集、分析、显示与存贮等，此为流式细胞仪的单细胞检测技术。 2.(1)淋巴细胞及其亚群的测定：通过FCM检测淋巴细胞的CD分子，可鉴定淋巴细胞 并计算出淋细胞各亚群的百分率：(2)淋巴细胞功能测定：通过FCM检测淋巴细胞的表面 受体及各种细胞因子，可区分各种淋巴细胞，并推测其功能。FCM还可快速测定混合淋巴细 胞培养、细胞介导细胞毒、细胞吞噬功能等：(3)白血病细胞免疫分型：FCM能快速、精 确地分析白血病细胞系免疫表型的来源及分化阶段，用于各种血液肿瘤的原发性诊断、鉴别、 分型分期、疗效观察、残存瘤细胞检测、肿瘤复发的早期发现、骨髓移植后的成功与再生检 测：(4)肿瘤耐药基因分析：FCM能快速检测细胞P-gP表达，报告MD并提示预测疗效， 及时更改治疗方案：(5)AIDS病程分析：通过FOM检测Th细胞绝对计数、Th/Tc比值，可 及时进行药物治疗干预和疗法评估：(6)自身免疫性疾病相关HLA分析：通过FCM检测细 胞某些LA异常表达，可用于多种生理和病理状态的研究。 3.细胞分选(cel1 sorting)是指从细胞群体中将选定的细胞分离出来。细胞分选时， 振荡装置充电产生每秒4万次的振动频率，使喷嘴射出一连串均匀的成千上万个小液滴，流 动的细胞就分散在这些小液滴中。此时，给细胞流束一个充电脉冲信号，选定细胞形成的液 滴带有特定的电荷，未被选定细胞形成的液滴和不含细胞的空白液滴均不带电荷。带有电荷 的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依据自身所带电荷正负向左或右发生偏转，落入各 自的收集容器中。不带电荷的水滴则垂直下流进入中间的废液容器中。 (曾常茜)
四、问答题 1.流式细胞仪是一种在计算机技术支持下高度自动化的显微荧光脉冲分光光度仪，可分 为三个部分：（1）细胞流动室及其液流驱动系统：细胞样品和包裹在外的鞘液在气体正压 的驱动下一起流经流动室，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个以相同的速度、相同的轨 迹通过检测区，此为流式细胞仪的单细胞流技术；（2）激发光及其光束成形系统：流式细 胞仪的激发光大多采用氩离子气体激光器，也可采用半导体激光器。仪器中一般都采用两块 相互垂直放置的柱面透镜组成光束成形系统，对激光束进行适当的聚焦，形成截面为椭圆形 的照射光斑即检测区。椭圆形光斑的检测区能保证样品中细胞是一个一个分别受到光照，并 且每一受检细胞都受到一致的光照激发，此为流式细胞仪中的单细胞照明技术；（3）细胞 信号检测与分析处理系统：细胞受到激发光照射时，产生散射光和荧光信号。光电倍增管及 其电子线路将每一细胞的光信号转换为相应的电信号，后者再通过模数转换器( ADC )量化 为数字信号，由计算机采集、分析、显示与存贮等，此为流式细胞仪的单细胞检测技术。 2.（1）淋巴细胞及其亚群的测定：通过 FCM 检测淋巴细胞的 CD 分子，可鉴定淋巴细胞 并计算出淋细胞各亚群的百分率；（2）淋巴细胞功能测定：通过 FCM 检测淋巴细胞的表面 受体及各种细胞因子，可区分各种淋巴细胞，并推测其功能。FCM 还可快速测定混合淋巴细 胞培养、细胞介导细胞毒、细胞吞噬功能等；（3）白血病细胞免疫分型：FCM 能快速、精 确地分析白血病细胞系免疫表型的来源及分化阶段，用于各种血液肿瘤的原发性诊断、鉴别、 分型分期、疗效观察、残存瘤细胞检测、肿瘤复发的早期发现、骨髓移植后的成功与再生检 测；（4）肿瘤耐药基因分析：FCM 能快速检测细胞 P-gp 表达，报告 MDR 并提示预测疗效， 及时更改治疗方案；（5）AIDS 病程分析：通过 FCM 检测 Th 细胞绝对计数、Th/Tc 比值，可 及时进行药物治疗干预和疗法评估；（6）自身免疫性疾病相关 HLA 分析：通过 FCM 检测细 胞某些 HLA 异常表达,可用于多种生理和病理状态的研究。 3. 细胞分选(cell sorting)是指从细胞群体中将选定的细胞分离出来。细胞分选时， 振荡装置充电产生每秒 4 万次的振动频率，使喷嘴射出一连串均匀的成千上万个小液滴，流 动的细胞就分散在这些小液滴中。此时，给细胞流束一个充电脉冲信号，选定细胞形成的液 滴带有特定的电荷，未被选定细胞形成的液滴和不含细胞的空白液滴均不带电荷。带有电荷 的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，依据自身所带电荷正负向左或右发生偏转，落入各 自的收集容器中。不带电荷的水滴则垂直下流进入中间的废液容器中。 （曾常茜）