第42卷第3期 Vol, 42 2019年3月 Environmental Science Technology Mar 203 肖鑫鑫,吴亦潇,丁惠君,等.武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究[环境科学与技术,2019,42(3):9-16. Xiao xinxin, Wu yixiao Ding Huijun, et al. Pollution characteristics of antibiotics and antibiotic resistance genes in urban lakes of wuhan[J]. Environmental Science Technolo gy,2019,42(3):9-16. 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征硏究 肖鑫鑫,吴亦潇,丁惠君2,万亮',杨文锋',张维昊 (1.武汉大学资源与环境科学学院,生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室,湖北 4.30079; 2.江西省水利科学研究院,江西省鄱阳湖水资源与环境重点实验室,江西南昌330029) 化△角要:为研究武汉城市湖泊抗生素及抗生素抗性基因的污染水平与分布特征,文章采用超高效液相色谐一质谱法和荧光定量 法对南湖、沙湖和东湖水体及底泥中12种抗生素、9种ARGs及I类整合子in进行定性和定量分析。结果表明,湖泊水体及底 泥中均以喹诺酮类抗生素污染为主,浓度范围分别为51.43-10562mg/和901-1293ng/ga10种目标基因中,lerG、ltM、sull、su2 qnD及inn的检出率均为100%。磺胺类抗性基因sall的相对丰度最高(239×10-2-3.99×10r-),属于优势抗性基因。iml含量与4种 抗性基因含量(eG、tetM、sl及qurD)、ARGs总量之间均存在显著正相关关系(P<0.05),说明inn是ARGs在城市湖泊环境中进行 水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类、喹诺酮类抗生素污染和in含量是影响湖泊水体、底泥中ARGs丰度及分布的 重要因素。 关键词:城市湖泊;抗生素;抗生素抗性基因;荧光定量PCR 中图分类号:X524文献标志码:Adoi:10.19672/cnki.1003-6504.20190300文章编号:1003-6504(201903-00-08 Pollution characteristics of antibiotics and antibiotic resistance genes in Urban Lakes of wuhan XIAO Xinxin, WU Yixiao, DING Huijun, WAN Liang YANG Wenfeng. ZHANG Weihao (1. School of Resource and Environmental Science, Hubei Key Laboratory for Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology, Wuhan University, Wuhan 430079, China: 2. Key Laboratory of Water Resources and Environment of Poyang Lake of Jiangxi Province, Jiangxi Province Institute of Water Science, Nanchang 330029. China) Abstract: In order to investigate the pollution status and distribution characteristics of antibiotics and antibiotic resistance genes(ARGs) in urban lakes of Wuhan, high performance liquid chromatography-mass spectrometry and quantitative PCr were applied to analyze the occurrence and quantities of twelve antibiotics, nine arGs and class I integron gene intl in water and sediment samples of South Lake, Sand Lake and East Lake. The results showed that quinolones were the main contami nants in all samples. The total concentration of quinolones ranged from 51.43 to 105.62 ng/L in water and from 9.01 to 12.93 ng/g in sediments. respectively. Among the ten tested genes, tetG, tetM, sull. sul2, qnrD as well as int/l had 100% detection frequency Sull had the highest relative abundance (2.39x 10-3.99x10), and was the predominant resistance gene. There was a significant positive correlation between the relative abundance of int/l and four resistance genes(terG, tetM, sull and qnrD) as well as total ARGs(P<0. 05), indicating that intl was a significant media for horizontal gene transfer of ARGs in ur- ban lakes. And redundancy analysis showed that tetracyclines, quinolones and int/l may play a very important role in the abun ance and distribution of args in urban lakes of wuhan Key words: urban lake; antibiotics; antibiotic resistance genes; qPCR 抗生素长期以来被大量应用于人类医疗、动物疾境中的化学药物污染,还会诱导产生抗生素耐药病原 病预防治疗、畜牧和水产养殖业等领域,不仅造成环菌和抗生素抗性基因叫。研究表明,在抗生素的选择 《环境科学与技术》编辑部:(网址)htp:/ ijks. chinajournalnetcn(电话)027-87643502(电子信箱) hjkxyjs@vip126com 收稿日期:2018-09-19;修回2018-12-13 基金项目:国家自然科学基金项目(51809006);江西省自然科学基金项目(20171BAB216050);江西省水利科技项目(KT201607,KT201702);武汉 大学大型仪器设备开放补贴资助项目(LF20181039) 作者简介:肖鑫鑫(1995-),女,硕士,研究方向为环境化学与分子生物学,(电子信箱)xlaoxinxin@whu.edu.cn;*通讯作者,(电子信箱)zhangwu@ whu.edu. cno
第3期 肖鑫鑫，吴亦潇，丁惠君，等. 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究[J].环境科学与技术，2019，42（3）：9-16. Xiao Xinxin，Wu Yixiao， Ding Huijun，et al. Pollution characteristics of antibiotics and antibiotic resistance genes in urban lakes of Wuhan[J]. Environmental Science & Technolo⁃ gy，2019，42（3）：9-16. 《环境科学与技术》编辑部：（网址）http://fjks.chinajournal.net.cn（电话）027-87643502（电子信箱）hjkxyjs@vip.126.com 收稿日期：2018-09-19；修回2018-12-13 基金项目：国家自然科学基金项目（51869006）；江西省自然科学基金项目（20171BAB216050）；江西省水利科技项目（KT201607，KT201702）；武汉 大学大型仪器设备开放补贴资助项目（LF20181039） 作者简介：肖鑫鑫（1995-），女，硕士，研究方向为环境化学与分子生物学，（电子信箱）xiaoxinxin@whu.edu.cn；*通讯作者，（电子信箱）zhangwh@ whu.edu.cn。 Environmental Science & Technology 第42卷 第3期 2019年3月 Vol.42 No.3 Mar. 2019 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 肖鑫鑫1 ， 吴亦潇1 ， 丁惠君2 ， 万亮1 ， 杨文锋1 ， 张维昊1* （1.武汉大学资源与环境科学学院，生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079； 2.江西省水利科学研究院，江西省鄱阳湖水资源与环境重点实验室，江西 南昌 330029） 摘 要：为研究武汉城市湖泊抗生素及抗生素抗性基因的污染水平与分布特征，文章采用超高效液相色谱-质谱法和荧光定量 PCR法对南湖、沙湖和东湖水体及底泥中12种抗生素、9种ARGs及Ⅰ类整合子intI1进行定性和定量分析。结果表明，湖泊水体及底 泥中均以喹诺酮类抗生素污染为主，浓度范围分别为 51.43~105.62 ng/L 和 9.01~12.93 ng/g。10 种目标基因中，tetG、tetM、sul1、sul2、 qnrD及intI1的检出率均为100%。磺胺类抗性基因sul1的相对丰度最高（2.39×10-2 ~3.99×10-1 ），属于优势抗性基因。intI1含量与4种 抗性基因含量（tetG、tetM、sul1及qnrD）、ARGs总量之间均存在显著正相关关系（P<0.05），说明intI1是ARGs在城市湖泊环境中进行 水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类、喹诺酮类抗生素污染和intI1含量是影响湖泊水体、底泥中ARGs丰度及分布的 重要因素。 关键词：城市湖泊； 抗生素； 抗生素抗性基因； 荧光定量PCR 中图分类号：X524 文献标志码：A doi：10.19672/j.cnki.1003-6504.2019.03.002 文章编号：1003-6504(2019)03-0009-08 Pollution Characteristics of Antibiotics and Antibiotic Resistance Genes in Urban Lakes of Wuhan XIAO Xinxin1 ， WU Yixiao1 ， DING Huijun2 ， WAN Liang1 ， YANG Wenfeng1 ， ZHANG Weihao1* （1. School of Resource and Environmental Science, Hubei Key Laboratory for Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology, Wuhan University, Wuhan 430079, China; 2. Key Laboratory of Water Resources and Environment of Poyang Lake of Jiangxi Province, Jiangxi Province Institute of Water Science, Nanchang 330029, China） Abstract：In order to investigate the pollution status and distribution characteristics of antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs) in urban lakes of Wuhan, high performance liquid chromatography-mass spectrometry and quantitative PCR were applied to analyze the occurrence and quantities of twelve antibiotics, nine ARGs and class I integron gene intI1 in water and sediment samples of South Lake, Sand Lake and East Lake. The results showed that quinolones were the main contami⁃ nants in all samples. The total concentration of quinolones ranged from 51.43 to 105.62 ng/L in water and from 9.01 to 12.93 ng/g in sediments, respectively. Among the ten tested genes, tetG, tetM, sul1, sul2, qnrD as well as intI1 had 100% detection frequency. Sul1 had the highest relative abundance (2.39×10-2 ~3.99×10-1 ), and was the predominant resistance gene. There was a significant positive correlation between the relative abundance of intI1 and four resistance genes (tetG, tetM, sul1 and qnrD) as well as total ARGs (P<0.05), indicating that intI1 was a significant media for horizontal gene transfer of ARGs in ur⁃ ban lakes. And redundancy analysis showed that tetracyclines, quinolones and intI1 may play a very important role in the abun⁃ dance and distribution of ARGs in urban lakes of Wuhan. Key words：urban lake; antibiotics; antibiotic resistance genes; qPCR 抗生素长期以来被大量应用于人类医疗、动物疾 病预防治疗、畜牧和水产养殖业等领域，不仅造成环 境中的化学药物污染，还会诱导产生抗生素耐药病原 菌和抗生素抗性基因[1] 。研究表明，在抗生素的选择
第42卷 压力下,动物肠道及粪便、废水中储存有大量抗性病区;而东湖作为中国第二大城中湖,周边是风景名胜 原菌,包括肠球菌、葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌区以及低强度建筑区。基于此,采用超高效液相色 等叫,其携带的抗性基因通过移动遗传元件介导在环谱-质谱法和荧光定量PCR法对3个湖泊水体及底泥 境中进行水平基因转移,严重威胁人类健康和生态安中12种抗生素、9种ARGs及I类整合子inn进行定 全。因此,抗生素及抗生素抗性基因( antibiotic resis-性和定量分析,揭示城市湖泊抗生素和ARGs的污染 tance genes,ARGs)污染已经成为全球性的环境问题水平与分布特征,并探讨抗生素、in和ARGs之间 之一。2006年, Pruden等首次提出将ARGs定义为的相关性,为城市湖泊抗生素尤其是ARGs的污染研 类新型环境污染物。由于ARGs在环境中的持久究提供数据基础,并为城市水环境风险评价和ARGs 性残留、传播和扩散,其对生态环境的危害更大于抗污染控制及管理提供科学依据 生素本身。而中国作为抗生素生产和消费大国,每 年消耗量超过16万t,其中约5万t以原药或代谢产物1材料与方法 形式排放到环境中,因此有必要加强我国关于抗生1.1标样与试剂 素及ARGs污染和传播等方面的研究。 抗生素标准品包括土霉素(OTC)、四环素(TC)、 近年来,国内外学者对于不同环境区域的抗生素金霉素(CT℃)、强力霉素(D℃)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺 和ARGs污染现状进行了大量的硏究。在美国、瑞上、噻唑(STZ)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、 中国等多个国家的河流湖泊、地下水、污水处理依诺沙星(ENX)、诺氟沙星(NFX)、氧氟沙星(OFX)、 厂进出水叫中均检测到不同程度的抗生素和ARGs污恩诺沙星(EFX),均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;甲 染,故水环境被认为是ARGs的一个重要储库。随醇、乙腈为色谱纯,甲酸、乙酸铵、乙二胺四乙酸二钠 着中国城市化的快速发展,长江中下游湖泊特别是城磷酸、磷酸二氢钾为分析纯,均购自国药集团化学试 市湖泊的环境污染问题日益严重,但目前针对城市湖剂有限公司 泊的研究多集中于富营养化、重金属等污染问题凵,1.2样品采集 有关抗生素残留和ARGs污染的调查较少,因此研究 采样区域为武汉市(11341-115°05E,29°58 城市湖泊抗生素及ARGs的污染特征对于了解其在城31°22N)的3个城市湖泊—一南湖、沙湖和东湖,其湖 市水环境中的传播和控制尤为重要。 泊形态学及周边人为影响信息见表1(武汉市水务局, 武汉市是中国中部经济发达、人口最多的城市,2013;武汉市环境保护局,2017;武汉市国土资源和规 其城市湖泊是长江中下游江汉湖区的重要组成部分,划局,2015)。按照地表水监测采样布点要求(国家环 具有防汛排涝、调节气候和改善城市生态环境等功境保护总局,2002)共设10个采样点,S1-3位于南湖 能。在武汉市166个湖泊中,被列入《武汉市中心城区S4-6位于沙湖,S7-10位于东湖。采样点分布见图l。 湖泊保护规划(2004-2020》的湖泊有39个。为体现因枯水季节水体和底泥中污染物受自然降水影响较 湖泊面积、水质现状及周边人为影响的差异性,本研小,更能反映水环境的真实污染状况,故采样时间 究选择武汉市三环内3个典型城市湖泊——南湖、沙定为2017年10月末。每个点采集水面下约0.5m处 湖和东湖作为研究对象,其中南湖和沙湖面积较小,的水样于棕色玻璃瓶中,4℃避光保存;用抓斗式采泥 周边有多家医院、污水处理厂、高校以及高强度建筑器采集底泥于封口袋中,-20℃保存。 表1湖泊形态学及人为影响信息 Table 1 Morphology properties and anthropic impact information of three lakes 湖泊面积km2水深/m水质现状营养状态周边医院数量污水处理厂数量居住用地建设强度公服用地建设强度 东湖 Ⅳ类轻度富营养 南湖 劣V类中度富营养 432 沙湖 劣V类重度富营养 注:周边居住用地及公共服务设施用地建设强度等级由低(5)到高(1)。 1.3抗生素分析 平,n=7),得到湖泊水体、底泥中抗生素的回收率分别 水体、底泥中抗生素的固相萃取前处理及仪器分在70%-130%、75%102%之间,检出限分别为0.18- 析方法详见文献[9,14],使用超高效液相色谱串联三280ng/L、0.31-1.21ng/go所有标准曲线的相关系数 重四级杆质谱(美国 Agilent)检测,通过外标法定量。均>0.992,符合分析要求 做空白及空白加标实验(50ngL和50ng/g的加标水14抗生素抗性基因分析
第42卷 压力下，动物肠道及粪便、废水中储存有大量抗性病 原菌，包括肠球菌、葡萄球菌、大肠杆菌及沙门氏菌 等[2] ，其携带的抗性基因通过移动遗传元件介导在环 境中进行水平基因转移，严重威胁人类健康和生态安 全。因此，抗生素及抗生素抗性基因（antibiotic resis⁃ tance genes, ARGs）污染已经成为全球性的环境问题 之一[3] 。2006 年，Pruden 等首次提出将 ARGs 定义为 一类新型环境污染物[4] 。由于ARGs在环境中的持久 性残留、传播和扩散，其对生态环境的危害更大于抗 生素本身[5] 。而中国作为抗生素生产和消费大国，每 年消耗量超过16万t，其中约5万t以原药或代谢产物 形式排放到环境中[6] ，因此有必要加强我国关于抗生 素及ARGs污染和传播等方面的研究。 近年来，国内外学者对于不同环境区域的抗生素 和ARGs污染现状进行了大量的研究。在美国、瑞士、 中国等多个国家的河流湖泊[7-9] 、地下水[10] 、污水处理 厂进出水[11] 中均检测到不同程度的抗生素和ARGs污 染，故水环境被认为是ARGs的一个重要储库[10] 。随 着中国城市化的快速发展，长江中下游湖泊特别是城 市湖泊的环境污染问题日益严重，但目前针对城市湖 泊的研究多集中于富营养化、重金属等污染问题[12] ， 有关抗生素残留和ARGs污染的调查较少，因此研究 城市湖泊抗生素及ARGs的污染特征对于了解其在城 市水环境中的传播和控制尤为重要。 武汉市是中国中部经济发达、人口最多的城市， 其城市湖泊是长江中下游江汉湖区的重要组成部分， 具有防汛排涝、调节气候和改善城市生态环境等功 能。在武汉市166个湖泊中，被列入《武汉市中心城区 湖泊保护规划（2004-2020）》的湖泊有39个。为体现 湖泊面积、水质现状及周边人为影响的差异性，本研 究选择武汉市三环内3个典型城市湖泊——南湖、沙 湖和东湖作为研究对象，其中南湖和沙湖面积较小， 周边有多家医院、污水处理厂、高校以及高强度建筑 区；而东湖作为中国第二大城中湖，周边是风景名胜 区以及低强度建筑区。基于此，采用超高效液相色 谱-质谱法和荧光定量PCR法对3个湖泊水体及底泥 中12种抗生素、9种ARGs及Ⅰ类整合子intI1进行定 性和定量分析，揭示城市湖泊抗生素和ARGs的污染 水平与分布特征，并探讨抗生素、intI1 和 ARGs 之间 的相关性，为城市湖泊抗生素尤其是ARGs的污染研 究提供数据基础，并为城市水环境风险评价和ARGs 污染控制及管理提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 标样与试剂 抗生素标准品包括土霉素（OTC）、四环素（TC）、 金霉素（CTC）、强力霉素（DC）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺 噻唑（STZ）、磺胺吡啶（SPD）、磺胺二甲嘧啶（SMZ）、 依诺沙星（ENX）、诺氟沙星（NFX）、氧氟沙星（OFX）、 恩诺沙星（EFX），均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲 醇、乙腈为色谱纯，甲酸、乙酸铵、乙二胺四乙酸二钠、 磷酸、磷酸二氢钾为分析纯，均购自国药集团化学试 剂有限公司。 1.2 样品采集 采样区域为武汉市（113°41'~115°05'E，29°58'~ 31°22'N）的3个城市湖泊——南湖、沙湖和东湖，其湖 泊形态学及周边人为影响信息见表1（武汉市水务局， 2013；武汉市环境保护局，2017；武汉市国土资源和规 划局，2015）。按照地表水监测采样布点要求（国家环 境保护总局，2002）共设10个采样点，S1~3位于南湖， S4~6位于沙湖，S7~10位于东湖。采样点分布见图1。 因枯水季节水体和底泥中污染物受自然降水影响较 小，更能反映水环境的真实污染状况[13] ，故采样时间 定为2017年10月末。每个点采集水面下约0.5 m处 的水样于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光保存；用抓斗式采泥 器采集底泥于封口袋中，-20 ℃保存。 湖泊 东湖 南湖 沙湖 面积/km2 33.99 7.67 3.08 水深/m 2.8 2.1 1.5 水质现状 Ⅳ类 劣Ⅴ类 劣Ⅴ类 营养状态 轻度富营养 中度富营养 重度富营养 周边医院数量 4 5 2 污水处理厂数量 2 1 0 居住用地建设强度 4 3 2 公服用地建设强度 5 4 3 表1 湖泊形态学及人为影响信息 Table 1 Morphology properties and anthropic impact information of three lakes 1.3 抗生素分析 水体、底泥中抗生素的固相萃取前处理及仪器分 析方法详见文献[9,14]，使用超高效液相色谱串联三 重四级杆质谱（美国 Agilent）检测，通过外标法定量。 做空白及空白加标实验（50 ng/L和50 ng/g的加标水 平，n=7），得到湖泊水体、底泥中抗生素的回收率分别 在 70%~130%、75%~102% 之间，检出限分别为 0.18~ 2.80 ng/L、0.31~1.21 ng/g。所有标准曲线的相关系数 均>0.992，符合分析要求。 1.4 抗生素抗性基因分析 注：周边居住用地及公共服务设施用地建设强度等级由低（5）到高（1）。 10
第3期 肖鑫鑫,等武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 及 Nanodrop20c( Thermo scientific,USA)超微量 分光光度计检测其纯度及浓度。 1.42普通PCR扩增 本研究选择了2组四环素类抗性基因(包括外排 泵基因tetA、eC、eG和核酸保护蛋白基因tetM terg)、磺胺类抗性基因(sll、sw2)、喹诺酮类抗性基 因(qnB、qnD)以及Ⅰ类整合子in共10种目标基 图1武汉市城市湖泊采样点分布 因。相关PCR引物和反应条件见表2。普通PCR反 Fig 1 Sampling sites of three lakes in Wuhan City 应体系(20μL)为:2 XPCR mix10μL,上、下游引物各 14.1DNA提取 1μL,BSA1μL,DNA模板1μL,dHo6μL。反应 水体及底泥样品的总DNA使用 FastDNA@ Spin程序为:94℃预变性5min;95℃变性15s,t(℃)退火 Kit for soil( MP Biomedicals,USA)提取,参照试剂盒30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃保持7min。得到 内说明书操作。提取的DNA用8%琼脂糖凝胶电泳的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行定性检测 表2目标基因的PCR引物和反应条件 Table 2 PCR primers and reaction conditions of target genes 目标基因 引物 序列(5’-3”) 退火温度n℃片段大小hp参考文献 teta-F GCTACATCCTGCTTGCCTTC tetA-R CATAGATCGCCGTGAAGAGG tetC-F TTACTCAGTGCCTGTTATAAGC tetC-R GCATCACTTCTTGGATAGGGATA terG-F GCACGCTGGTTTGGCTACA teIG-R TGGCTGTGATTAGTCTCCTTGA tetM-F CCGTTGGGAAGTGGAATGC tetM-R TCCGAAAATCTGCTGGGGTA terO-F AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG ter@-R CGGAGTGTCAATGATATTGCA sull-F CACCGGAAACATCGCTGCA sull-R AAGTTCCGCCGCAAGGCT su/2-F CTCCGATGGAGGCCGGTAT sub2-R GGGAATGCCATCTGCCTTGA B qnrB-F GCGACGTTCAGTGGTTCAO 54.7 148 gnrB-R TGTCCAACTTAACGCCTTGTAA qnrD-F AGTGAGTGTTTAGCTCAAGGAG qnrD-R CAGTGCCATTCCAGCGATT GGCTTCGTGATGCCTGCTT int/l-R CATTCCTGGCCGTGGTTCT l6S rDNA CGAATATGGAATCCCTAGTAACT 16S-R GCCCACTCAGTTCGATACGC 143实时荧光定量PCR s;T(℃)退火20s,72℃延伸30s,40个循环;在72℃ 使用 StepOnePlus Real- Time PCR System(Ap-延伸的同时收集荧光信号。扩增结束后以0.3℃/min plied Biosystems,USA)实时荧光定量PCR仪对目标的升温速率从60℃至95℃做熔解曲线。每次qPCR 基因进行定量检测。定量PCR反应体系(20μL)实验采用dH作为阴性对照,所有样品均设置3 为:2 XSYBR Green I Premix10μL,上、下游引物各个平行样。 0.6μL,ROX0.4μL,DNA模板1μL,ddHO7.4 标准质粒的构建详见文献13]。提取的质粒DNA L。反应程序为:95℃预变性15min;95℃变性10用 Nanodrop2000c( Thermo scientific,USA)超微量
第3期 1.4.1 DNA提取 水体及底泥样品的总 DNA 使用 FastDNA® Spin Kit for Soil（MP Biomedicals, USA）提取，参照试剂盒 内说明书操作。提取的 DNA 用 8% 琼脂糖凝胶电泳 及 Nanodrop 2000c（Thermo Scientific, USA）超微量 分光光度计检测其纯度及浓度。 1.4.2 普通PCR扩增 本研究选择了2组四环素类抗性基因（包括外排 泵基因 tetA、tetC、tetG 和核酸保护蛋白基因 tetM、 tetQ）、磺胺类抗性基因（sul1、sul2）、喹诺酮类抗性基 因（qnrB、qnrD）以及Ⅰ类整合子 intI1 共 10 种目标基 因。相关 PCR 引物和反应条件见表 2。普通 PCR 反 应体系（20 μL）为：2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各 1 μL，BSA 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 6 μL。反应 程序为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，（t ℃）退火 30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃保持7 min。得到 的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行定性检测。 目标基因 tetA tetC tetG tetM tetQ sul1 sul2 qnrB qnrD intI1 16S rDNA 引物 tetA-F tetA-R tetC-F tetC-R tetG-F tetG-R tetM-F tetM-R tetQ-F tetQ-R sul1-F sul1-R sul2-F sul2-R qnrB-F qnrB-R qnrD-F qnrD-R intI1-F intI1-R 16S-F 16S-R 序列（5’-3’） GCTACATCCTGCTTGCCTTC CATAGATCGCCGTGAAGAGG TTACTCAGTGCCTGTTATAAGC GCATCACTTCTTGGATAGGGATA GCACGCTGGTTTGGCTACA TGGCTGTGATTAGTCTCCTTGA CCGTTGGGAAGTGGAATGC TCCGAAAATCTGCTGGGGTA AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG CGGAGTGTCAATGATATTGCA CACCGGAAACATCGCTGCA AAGTTCCGCCGCAAGGCT CTCCGATGGAGGCCGGTAT GGGAATGCCATCTGCCTTGA GCGACGTTCAGTGGTTCAG TGTCCAACTTAACGCCTTGTAA AGTGAGTGTTTAGCTCAAGGAG CAGTGCCATTCCAGCGATT GGCTTCGTGATGCCTGCTT CATTCCTGGCCGTGGTTCT CGAATATGGAATCCCTAGTAACT GCCCACTCAGTTCGATACGC 退火温度t/℃ 54.6 56 56 57 53 57.5 60 54.7 56.8 57 58 片段大小/bp 210 166 176 196 169 158 190 148 175 146 140 参考文献 [11] [11] [11] [8] [8] [8] [8] [11] [11] [8] [8] 表2 目标基因的PCR引物和反应条件 Table 2 PCR primers and reaction conditions of target genes 1.4.3 实时荧光定量PCR 使用 StepOnePlusTM Real-Time PCR System（Ap⁃ plied Biosystems, USA）实时荧光定量 PCR 仪对目标 基因进行定量检测。定量 PCR 反应体系（20 μL） 为：2×SYBR GreenⅠPremix 10 μL，上、下游引物各 0.6 μL，ROX 0.4 μL，DNA 模 板 1 μL，ddH2O 7.4 μL。反应程序为：95 ℃预变性 15 min；95 ℃变性 10 s；T（℃）退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；在72 ℃ 延伸的同时收集荧光信号。扩增结束后以0.3 ℃/min 的升温速率从60 ℃至95 ℃做熔解曲线。每次qPCR 实验采用 ddH2O 作为阴性对照，所有样品均设置 3 个平行样。 标准质粒的构建详见文献[13]。提取的质粒DNA 用 Nanodrop 2000c（Thermo Scientific, USA）超微量 肖鑫鑫，等 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 11
第42卷 分光光度计检测其浓度,并将该浓度的质粒DNA以 10倍梯度稀释来建立标准曲线。所有标准曲线的相 2结果与讨论 关系数均>0991,扩增效率在85%-105%之间,证明线2.1抗生素污染特征 性关系良好,可用于计算各基因的拷贝数。 武汉市3个城市湖泊水体和底泥中12种抗生素 1.5数据分析 的含量见表3及4。结果显示,除磺胺噻唑STZ、磺胺 使用 Excel和SPSS190软件对所有数据进行统吡啶SPD外,其余10种抗生素在水体和底泥样品中 计分析,用线性回归进行相关性分析(P<0.05表示显均有检出,说明武汉城市湖泊已广泛受到多种抗生素 著相关),用 Canoco40软件进行冗余分析。 不同程度的污染。 表3湖泊水体中12种抗生素的含量 Table 3 Concentrations of 12 classes of antibiotics in water of three lakes 南湖水体 沙湖水体 东湖水体 抗生素含量范围 平均值检出率 含量范围 平均值检出率 含量范围平均值检出率 5.31 3.71-6.50 10 5.75-6.20 2.87-3.85 CTC 2.17 ND-937 DC13.73-2931 20.43 9.38-13.9 l13 8.10-1153994 ∑TCs21.41-43.433120 6-2903 15.42-24.641947 SD3.52-20.48 1087 ND4.17 SMZ ND-4.17 ENX13.91-18.4915.70 18.55-22.38 20.12 1742-26.16 NFX12.77-29.77 23.92 10 12.55-37.582121 OFX16.82-73.1542.69100 3.68-12.76 4.40-12428.46100 EFX10.75-3791 100 2.20-3.57 4.15-8.21 ∑QUs70.70-155.5210562 37.85-75.09 49.49-83.31 注:ND表示未检出 表4湖泊底泥中12种抗生素的含量 Table 4 Concentrations of 12 classes of antibiotics in sediments of three lakes 南湖底泥 沙湖底泥 抗生素含量范围 平均值检出率 含量范围 平均值检出率 含量范围 平均值检出率 /(ngg" /ngg")/ng·g") /ngg")/ng·g") 147-2.96 ND-1.55 ND-1.69 ND-265 ∑TCs1.47-1032 ND-1.55 ND-1.69 STZ SMZ ND- 0.84 0.34-160 149 ∑ SAS ND-2.53 0.84 0.34-1.60 ND-3.23 1.49 ENX 65-2.74 196-3.1 1.39-2.56 2.84-6.47 2.13-5.04 1.76-12.58 OFX1.32-5.56 3.94 L26-2.6l .46-301 FX1.17-2.26 155 1.23-1.66 149 ND-1.49 0.96 ∑QUs697-1689 12.93 100 723-1198 9.0l 5.76-1785 注:ND表示未检出
第42卷 分光光度计检测其浓度，并将该浓度的质粒 DNA 以 10倍梯度稀释来建立标准曲线。所有标准曲线的相 关系数均>0.991，扩增效率在85%~105%之间，证明线 性关系良好，可用于计算各基因的拷贝数。 1.5 数据分析 使用 Excel 和 SPSS 19.0 软件对所有数据进行统 计分析，用线性回归进行相关性分析（P<0.05表示显 著相关），用Canoco 4.0软件进行冗余分析。 2 结果与讨论 2.1 抗生素污染特征 武汉市3个城市湖泊水体和底泥中12种抗生素 的含量见表3及4。结果显示，除磺胺噻唑STZ、磺胺 吡啶 SPD 外，其余 10 种抗生素在水体和底泥样品中 均有检出，说明武汉城市湖泊已广泛受到多种抗生素 不同程度的污染。 抗生素 OTC TC CTC DC ∑TCs SD STZ SPD SMZ ∑SAs ENX NFX OFX EFX ∑QUs 南湖水体 含量范围 /(ng·L-1 ) 3.96~7.62 3.71~6.50 ND 13.73~29.31 21.41~43.43 3.52~20.48 ND ND ND 3.52~20.48 13.91~18.49 12.77~29.77 16.82~73.15 10.75~37.91 70.70~155.52 平均值 /(ng·L-1 ) 5.31 5.46 ND 20.43 31.20 10.87 ND ND ND 10.87 15.70 23.92 42.69 23.31 105.62 检出率 /% 100 100 0 100 100 100 0 0 0 100 100 100 100 100 100 沙湖水体 含量范围 /(ng·L-1 ) 3.75~7.56 5.75~6.20 ND~5.20 9.38~13.97 20.06~29.03 ND~0.81 ND ND ND ND~0.81 18.55~22.38 12.55~37.58 3.68~12.76 2.20~3.57 37.85~75.09 平均值 /(ng·L-1 ) 5.92 5.95 2.17 11.3 25.34 0.39 ND ND ND 0.39 20.12 21.21 7.38 2.72 51.43 检出率 /% 100 100 67 100 100 67 0 0 0 67 100 100 100 100 100 东湖水体 含量范围 /(ng·L-1 ) ND~5.40 2.87~3.85 ND~9.37 8.10~11.53 15.42~24.64 ND~4.17 ND ND ND ND~4.17 17.42~26.16 11.99~41.28 4.40~12.42 4.15~8.21 49.49~83.31 平均值 /(ng·L-1 ) 3.36 3.31 2.86 9.94 19.47 1.66 ND ND ND 1.66 20.72 32.04 8.46 6.39 67.61 检出率 /% 75 100 50 100 100 50 0 0 0 50 100 100 100 100 100 表3 湖泊水体中12种抗生素的含量 Table 3 Concentrations of 12 classes of antibiotics in water of three lakes 注：ND表示未检出。 抗生素 OTC TC CTC DC ∑TCs SD STZ SPD SMZ ∑SAs ENX NFX OFX EFX ∑QUs 南湖底泥 含量范围 /(ng·g-1 ) ND~4.71 1.47~2.96 ND ND~2.65 1.47~10.32 ND ND ND ND~2.53 ND~2.53 1.65~2.74 2.84~6.47 1.32~5.56 1.17~2.26 6.97~16.89 平均值 /(ng·g-1 ) 2.73 2.05 ND 0.88 5.66 ND ND ND 0.84 0.84 2.22 5.22 3.94 1.55 12.93 检出率 /% 67 100 0 33 100 0 0 0 33 33 100 100 100 100 100 沙湖底泥 含量范围 /(ng·g-1 ) ND ND~1.55 ND ND ND~1.55 ND ND ND 0.34~1.60 0.34~1.60 1.96~3.11 2.13~5.04 1.26~2.61 1.23~1.66 7.23~11.98 平均值 /(ng·g-1 ) ND 1.00 ND ND 1.00 ND ND ND 0.93 0.93 2.63 3.17 1.72 1.49 9.01 检出率 /% 0 67 0 0 67 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 东湖底泥 含量范围 /(ng·g-1 ) ND ND~1.69 ND ND ND~1.69 ND ND ND ND~3.23 ND~3.23 1.39~2.56 1.76~12.58 1.46~3.01 ND~1.49 5.76~17.85 平均值 /(ng·g-1 ) ND 0.81 ND ND 0.81 ND ND ND 1.49 1.49 1.97 5.10 1.96 0.96 9.99 检出率 /% 0 50 0 0 50 0 0 0 75 75 100 100 100 75 100 表4 湖泊底泥中12种抗生素的含量 Table 4 Concentrations of 12 classes of antibiotics in sediments of three lakes 注：ND表示未检出。 12
第3期 肖鑫鑫,等武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 湖泊水体中四环素类抗生素的浓度范围为的检出率均为100%,其余依次为tet(70‰%)、teQ 19.47-31.20ng/,磺胺类为0.3-1087ng/L,喹诺酮(70%)、terc(65%)和qnB(35%),说明抗生素抗性基 类为5143-10562ngL;底泥中三大类抗生素的浓度因已普遍存在于武汉城市湖泊环境中。 范围分别为0.81-566、084-149和901-1293ng/g。2.2,2ARGs定量分析 上述结果表明,武汉城市湖泊抗生素污染以喹诺酮类 本研究选择具有100%检出率的6种目标基因 为主,四环素类和磺胺类次之。这三大类抗生素的含teG、tetM、sull、s2、qnrD及in)进行荧光定量 量差异可能与其在水环境中的稳定性、迁移性及周边PCR分析。为避免DNA提取效率及环境微生物背景 区域用药特征有关。其中四环素类在水体和底泥值的差异回,使用相对定量来分析湖泊水体和底泥中 中的含量存在显著正相关关系(m=066,P1为高风险。经计算, 8.0E-03 4.0E=03 OFX和FFX这2种喹诺酮类抗生素具有高风险,说 明其对武汉城市湖泊中相应敏感水生生物存在较高 东湖 的急性或慢性毒性风险;DC和NFX表现出中等风 图3湖泊底泥中目标基因的相对丰度 Fig 3 Relative abundance of target genes in sediments of three lakes 险,其余四环素类及磺胺类抗生素的风险较低。总 与抗生素浓度水平的分布趋势相似,ARGs总相 体而言,当前武汉城市湖泊抗生素尤其是喹诺酮类对丰度同样在南湖最高,在水体和底泥中分别为 的污染问题不容忽视,应当加强控制和管理,降低其1.63×104和504×10-,其次为沙湖(2.58×10-2和5.05× 生态风险。 10-)还有东湖(250×102和261×10)。ARGs在南湖 3个城市湖泊中,南湖的抗生素总含量最高,在水的高检出率(100%)及其高含量水平可能与周边多种 体和底泥中分别为14769ng/和1943ng/g。这可能污染源和人为影响有关,它反映了相应类型抗生素 与南湖附近5家医院、1个污水处理厂、4所高校及中的广泛使用及其在该地区的巨大环境风险。沙湖周 等强度建筑区有关,其较高的抗生素含量受到周边环边虽然没有污水处理厂,医院数量也较少,但高强度 境中医疗废水、工业污水、大学实验废水及居民生活建筑区伴随着密集的人类活动同样导致了较强的 污水等多种污染源的影响凹,说明湖泊水体和底泥中ARGs污染。而东湖作为中国第二大城中湖,面积为 不同抗生素的污染程度反映了城市湖泊周边区域抗3399km2,其较大的湖泊环境容量及较强的水体自净 生素的使用及排放特征。 能力削弱了附近医院、污水处理厂造成的污染影响。 22ARGs污染特征 并且东湖周边是风景名胜区和低强度建筑区,以旅游 221ARGs定性分析 休闲为主的人类活动造成的人为污染影响更少。以上 以5种四环素类抗性基因、2种磺胺类抗性基因、结果表明,位于髙强度建筑区且受人为影响较大的南 2种喹诺酮类抗性基因及Ⅰ类整合子il为目标基湖和沙湖具有更高的抗性基因多样性及相对丰度。 因,对3个城市湖泊的所有水体及底泥样品进行定性 5种ARGs中磺胺类抗性基因sa的相对含量最 检测。结果显示,etG、tetM、sull、su2、qnrD及in1高,在湖泊水体和底泥中的相对丰度平均值分别为
第3期 湖泊水体中四环素类抗生素的浓度范围为 19.47~31.20 ng/L，磺胺类为 0.39~10.87 ng/L，喹诺酮 类为51.43~105.62 ng/L；底泥中三大类抗生素的浓度 范围分别为 0.81~5.66、0.84~1.49 和 9.01~12.93 ng/g。 上述结果表明，武汉城市湖泊抗生素污染以喹诺酮类 为主，四环素类和磺胺类次之。这三大类抗生素的含 量差异可能与其在水环境中的稳定性、迁移性及周边 区域用药特征有关[15] 。其中四环素类在水体和底泥 中的含量存在显著正相关关系（r=0.66，P<0.05），说明 四环素类抗生素在两相之间进行过显著的分配交换， 达到动态平衡。 本研究水体中主要抗生素类型喹诺酮类与南昌 城市湖泊[16] 的检出浓度（ND~97.2 ng/L）在同一数量 级，高于太湖[17] 、博斯腾湖[18] 和鄱阳湖[9] 的检出水平，但 远低于温榆河[19] 和大辽河[20] 的最大检出浓度（分别为 1 213.6 ng/L和214 ng/L）；而底泥中抗生素总含量与 白洋淀[21] 、海河流域[8] 、洪湖和洞庭湖[22] 及美国卡凯 河[4] 的检出水平相比均较低。由此可见，与国内外其 他湖泊河流相比，武汉城市湖泊抗生素污染总体处于 中等偏低水平。根据欧盟技术指导文件（TGD）中环 境风险评价的方法[23] 计算湖泊水体中各抗生素的RQs （风险商值），并按照Hernando等[24] 提出的RQs分类方 法表征生态风险的不同程度：RQs＜0.1为最低风险， 0.1≤RQs＜1为中等风险，RQs≥1为高风险。经计算， OFX 和 EFX 这 2 种喹诺酮类抗生素具有高风险，说 明其对武汉城市湖泊中相应敏感水生生物存在较高 的急性或慢性毒性风险；DC 和 NFX 表现出中等风 险，其余四环素类及磺胺类抗生素的风险较低。总 体而言，当前武汉城市湖泊抗生素尤其是喹诺酮类 的污染问题不容忽视，应当加强控制和管理，降低其 生态风险。 3个城市湖泊中，南湖的抗生素总含量最高，在水 体和底泥中分别为147.69 ng/L和19.43 ng/g。这可能 与南湖附近5家医院、1个污水处理厂、4所高校及中 等强度建筑区有关，其较高的抗生素含量受到周边环 境中医疗废水、工业污水、大学实验废水及居民生活 污水等多种污染源的影响[25] ，说明湖泊水体和底泥中 不同抗生素的污染程度反映了城市湖泊周边区域抗 生素的使用及排放特征。 2.2 ARGs污染特征 2.2.1 ARGs定性分析 以5种四环素类抗性基因、2种磺胺类抗性基因、 2 种喹诺酮类抗性基因及Ⅰ类整合子 intI1 为目标基 因，对3个城市湖泊的所有水体及底泥样品进行定性 检测。结果显示，tetG、tetM、sul1、sul2、qnrD 及 intI1 的检出率均为 100%，其余依次为 tetA（70%）、tetQ （70%）、tetC（65%）和 qnrB（35%），说明抗生素抗性基 因已普遍存在于武汉城市湖泊环境中。 2.2.2 ARGs定量分析 本研究选择具有 100% 检出率的 6 种目标基因 （tetG、tetM、sul1、sul2、qnrD 及 intI1）进行荧光定量 PCR分析。为避免DNA提取效率及环境微生物背景 值的差异[22] ，使用相对定量来分析湖泊水体和底泥中 6种目标基因的含量分布情况，结果见图2、3。 与抗生素浓度水平的分布趋势相似，ARGs总相 对丰度同样在南湖最高，在水体和底泥中分别为 1.63×10-1 和5.04×10-1 ，其次为沙湖（2.58×10-2 和5.05× 10-1 ）还有东湖（2.50×10-2 和2.61×10-1 ）。ARGs在南湖 的高检出率（100%）及其高含量水平可能与周边多种 污染源和人为影响有关[25] ，它反映了相应类型抗生素 的广泛使用及其在该地区的巨大环境风险。沙湖周 边虽然没有污水处理厂，医院数量也较少，但高强度 建筑区伴随着密集的人类活动同样导致了较强的 ARGs污染。而东湖作为中国第二大城中湖，面积为 33.99 km2 ，其较大的湖泊环境容量及较强的水体自净 能力削弱了附近医院、污水处理厂造成的污染影响。 并且东湖周边是风景名胜区和低强度建筑区，以旅游 休闲为主的人类活动造成的人为污染影响更少。以上 结果表明，位于高强度建筑区且受人为影响较大的南 湖和沙湖具有更高的抗性基因多样性及相对丰度。 5种ARGs中磺胺类抗性基因sul1的相对含量最 高，在湖泊水体和底泥中的相对丰度平均值分别为 肖鑫鑫，等 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 13
14 第42卷 239×10-和399×10-,属于环境中优势抗性基因。这及表达抗性基因叫。根据intl基因编码的不同整合酶 与在瑞士湖泊、长江口及附近沿海地区得到的结可以将整合子主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子,其中I 论一致,可能与磺胺类抗性基因的宿主菌在环境中较类整合子inl日益成为与ARGs有关的研究热点。 强的耐受性有关。2种四环素类抗性基因中,teG在研究表明,i可通过位点特异性重组将不同ARGs 水体和底泥中的相对含量较高(3.15×102和1.11×进行重排,进而通过接合型质粒促进其在环境中的传 10-2),而teM的含量较低(542×10和3.23×10-),这播扩散門。 种显著性差异(teO>teM,P<0.05)可能与区域内四环 在本研究的3个城市湖泊中,in的相对丰度由 素类抗生素使用模式、相应抗性机制及其宿主细菌种高到低依次为南湖(1.03×10-)、沙湖(6.86×103)和东 类的不同有关。此外,喹诺酮类抗性基因qnD和Ⅰ湖(371×10-),含量水平仅次于sl1和terG,说明武汉 类整合子int的相对丰度分别在299×103-3.17×103城市湖泊的inn污染水平也较严重。Luo等在海河 及4.26×10-9.65×10范围内。以上结果表明,武汉流域的研究发现il与sul的相对丰度存在显著相 城市湖泊ARGs的相对含量总体在10-10数量级范关性,并证实inn可介导sll在环境中的水平传播; 围,与海河流域、黄浦江水域¤及长江中下游众多湖还有临床硏究发现携带ii的菌株比普通菌株更容 泊的调查结果相近,但高于美国卡凯河及广东西易诱导产生多重耐药性。本研究湖泊水体及底泥 枝江-东江流域的含量水平,说明武汉城市湖泊已样品中innl与各种ARGs的相关性分析如表5所示。 成为抗性基因的一个重要储库 结果显示,除s2外,其余4种抗性基因及总ARGs均 23innl与ARGs的相关性分析 与inn存在显著正相关关系(P<0.05),说明inn是 介导水平基因转移的移动遗传元件是ARGs在环ARGs在城市湖泊环境中进行水平基因转移的重要媒 境中广泛传播的重要途径,例如整合子和质粒。介,进而促进多重耐药性在环境致病菌群之间的传播 整合子是一种基因重组表达系统,能够捕获、整合以和扩散 表5int1与抗性基因的相关性分析 Table 5 Correlation analysis between intl1 and resistance genes 总ARGs 水体 0.38 注:*表示P<0.05。 24ARGs影响因素分析 环境污染控制和管理提供了科学依据。 已有研究证明抗生素、in咧等多种因素都会 不同研究对于抗生素浓度与ARGs丰度之间的相 影响环境中ARGs的丰度。本研究选择几种主要抗生关关系得到的结论并不一致,目前更多的硏究表明 素及in作为环境变量,探究湖泊水体和底泥中环境ARGs丰度不仅受到环境中抗生素残留的影响,还可 变量与ARGs丰度之间的潜在关系。冗余分析(图4、能与其他环境因子或污染物有关。Pei、 Engemann s 5)结果表明水体和底泥的主成分轴RDAI与RDA2的等研究发现高温、厌氧、光照处理均能加快ARGs的降 累计贡献率分别达到99.3%和623%。对于水体,图4解,其他研究表明重金属和抗生素的协同选择可能会 显示除ENX、NFX外,其它抗生素及in均与5种诱导微生物群落产生多重耐药性,提高环境中ARGs ARGs存在正相关关系,其中解释ARGs变异贡献率的丰度門。虽然本研究对武汉城市湖泊抗生素、I类 较大的环境因子分别为DC(49%)、inn1(20%)和OTC整合子innl和ARGs进行了相关分析,但后续仍需对 (18%),说明四环素类抗生素和in含量是对湖泊水城市湖泊抗生素及ARGs污染的传播扩散机制和控制 体中ARGs丰度及分布的主要驱动因素。对于底泥,管理对策等开展更多研究。 图5显示il、 NFX ENX、OFX与四环素类抗性基因 3结论 tetM、磺胺类抗性基因sull及喹诺酮类抗性基因φD 存在显著相关性,其贡献率分别为26%、15%、15%和 (1)武汉城市湖泊已广泛受到喹诺酮类、四环素 ∏1%,说明喹诺酮类抗生素和innl含量是影响湖泊底类及磺胺类抗生素污染,与其他湖泊河流相比总体处 泥中ARGs丰度及分布的主要因素。冗余分析结果进于中等偏低水平。湖泊水体和底泥中均以喹诺酮类 步证实了in与ARGs的相关性分析结果,并为今污染为主,浓度范围分别为51.43-10562ngL和901 后对城市湖泊抗生素尤其是四环素类及喹诺酮类的1293ng/g
第42卷 2.39×10-2 和3.99×10-1 ，属于环境中优势抗性基因。这 与在瑞士湖泊[7] 、长江口及附近沿海地区[26] 得到的结 论一致，可能与磺胺类抗性基因的宿主菌在环境中较 强的耐受性有关[8] 。2种四环素类抗性基因中，tetG在 水体和底泥中的相对含量较高（3.15×10-2 和 1.11× 10-2 ），而 tetM 的含量较低（5.42×10-4 和 3.23×10-4 ），这 种显著性差异（tetG>tetM，P<0.05）可能与区域内四环 素类抗生素使用模式、相应抗性机制及其宿主细菌种 类的不同有关[27] 。此外，喹诺酮类抗性基因qnrD和Ⅰ 类整合子intI1的相对丰度分别在2.99×10-3 ~3.17×10-3 及 4.26×10-3 ~9.65×10-3 范围内。以上结果表明，武汉 城市湖泊ARGs的相对含量总体在10-1 ~10-4 数量级范 围，与海河流域[8] 、黄浦江水域[27] 及长江中下游众多湖 泊[28] 的调查结果相近，但高于美国卡凯河[4] 及广东西 枝江-东江流域[13] 的含量水平，说明武汉城市湖泊已 成为抗性基因的一个重要储库。 2.3 intI1与ARGs的相关性分析 介导水平基因转移的移动遗传元件是ARGs在环 境中广泛传播的重要途径，例如整合子[29] 和质粒[30] 。 整合子是一种基因重组表达系统，能够捕获、整合以 及表达抗性基因[31] 。根据intI基因编码的不同整合酶 可以将整合子主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子，其中Ⅰ 类整合子 intI1 日益成为与 ARGs 有关的研究热点。 研究表明，intI 可通过位点特异性重组将不同 ARGs 进行重排，进而通过接合型质粒促进其在环境中的传 播扩散[29] 。 在本研究的3个城市湖泊中，intI1的相对丰度由 高到低依次为南湖（1.03×10-2 ）、沙湖（6.86×10-3 ）和东 湖（3.71×10-3 ），含量水平仅次于sul1和tetG，说明武汉 城市湖泊的intI1污染水平也较严重。Luo等[8] 在海河 流域的研究发现intI1与sul1的相对丰度存在显著相 关性，并证实intI1可介导sul1在环境中的水平传播； 还有临床研究发现携带intI1的菌株比普通菌株更容 易诱导产生多重耐药性[32] 。本研究湖泊水体及底泥 样品中intI1与各种ARGs的相关性分析如表5所示。 结果显示，除sul2外，其余4种抗性基因及总ARGs均 与 intI1 存在显著正相关关系（P<0.05），说明 intI1 是 ARGs在城市湖泊环境中进行水平基因转移的重要媒 介，进而促进多重耐药性在环境致病菌群之间的传播 和扩散。 intI1 样品 水体 底泥 tetG 0.72* 0.63* tetM 0.72* 0.44 sul1 0.69* 0.76* sul2 0.38 0.38 qnrD 0.68* 0.37 总ARGs 0.71* 0.77* 表5 intI1与抗性基因的相关性分析 Table 5 Correlation analysis between intI1 and resistance genes 注：*表示P<0.05。 2.4 ARGs影响因素分析 已有研究证明抗生素[8] 、intI1[29] 等多种因素都会 影响环境中ARGs的丰度。本研究选择几种主要抗生 素及intI1作为环境变量，探究湖泊水体和底泥中环境 变量与ARGs丰度之间的潜在关系。冗余分析（图4、 5）结果表明水体和底泥的主成分轴RDA1与RDA2的 累计贡献率分别达到99.3%和62.3%。对于水体，图4 显示除 ENX、NFX 外，其它抗生素及 intI1 均与 5 种 ARGs 存在正相关关系，其中解释 ARGs 变异贡献率 较大的环境因子分别为DC（49%）、intI1（20%）和OTC （18%），说明四环素类抗生素和intI1含量是对湖泊水 体中ARGs丰度及分布的主要驱动因素。对于底泥， 图5显示intI1、NFX、ENX、OFX与四环素类抗性基因 tetM、磺胺类抗性基因sul1及喹诺酮类抗性基因qnrD 存在显著相关性，其贡献率分别为 26%、15%、15% 和 11%，说明喹诺酮类抗生素和intI1含量是影响湖泊底 泥中ARGs丰度及分布的主要因素。冗余分析结果进 一步证实了intI1与ARGs的相关性分析结果，并为今 后对城市湖泊抗生素尤其是四环素类及喹诺酮类的 环境污染控制和管理提供了科学依据。 不同研究对于抗生素浓度与ARGs丰度之间的相 关关系得到的结论并不一致，目前更多的研究表明 ARGs丰度不仅受到环境中抗生素残留的影响，还可 能与其他环境因子或污染物有关。Pei[33] 、Engemann[34] 等研究发现高温、厌氧、光照处理均能加快ARGs的降 解，其他研究表明重金属和抗生素的协同选择可能会 诱导微生物群落产生多重耐药性，提高环境中ARGs 的丰度[25] 。虽然本研究对武汉城市湖泊抗生素、Ⅰ类 整合子intI1和ARGs进行了相关分析，但后续仍需对 城市湖泊抗生素及ARGs污染的传播扩散机制和控制 管理对策等开展更多研究。 3 结论 （1）武汉城市湖泊已广泛受到喹诺酮类、四环素 类及磺胺类抗生素污染，与其他湖泊河流相比总体处 于中等偏低水平。湖泊水体和底泥中均以喹诺酮类 污染为主，浓度范围分别为51.43~105.62 ng/L和9.01~ 12.93 ng/g。 14
第3期 肖鑫鑫,等武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 NFX intIl ENX RDAI RDAI 图4湖泊水体中抗生素、int/l与抗性基因的冗余分析 图5湖泊底泥中抗生素、i与抗性基因的冗余分析 Fig 4 Redundancy analysis(RDA)between Fig 5 Redundancy analysis(RDA)between antibiotics in/l and ARGs in water antibiotics. int/l and ARGs in sediments (2)9种ARGs及inl在武汉城市湖泊均有不同 genes as emerging contaminants: studies in Northern Colora- 程度的检出,说明城市湖泊是ARGs的一个重要储库。 do[]. Environmental Science and Technology, 2006, 40(23 ): 其中磺胺类抗性基因sull的相对丰度最高(2.39 7445. 102-3.99×10-),属于优势抗性基因。 5]苏建强,黄福义朱永官.环境抗生素抗性基因研究进展门 (3)在武汉市3个城市湖泊中,南湖的抗生素总含 生物多样性,2013,21(4):481-487 量、抗性基因多样性及总相对丰度最高,沙湖和东湖 Su Jianqiang, Huang Fuyi, Zhu Yongguan. Antibiotic resis- tance genes in the environment[J]. Biodiversity Science, 次之。 2013.21(4):481-487 (4)in含量与4种抗性基因含量(terG、tetM、 I Zhang QQ.YngG,Panc, et al. Comprehensive evalua l及qnD)、ARGs总量之间均存在显著正相关关系 tion of antibiotics emission and fate in the river basins of (P<0.05),说明inn是ARGs在城市湖泊环境中进行 China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to 水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类 bacterial resistance[J]. Environmental Science and Technolo 喹诺酮类抗生素污染和in含量是影响湖泊水体、底 gy,2015,4911)6772-6782 泥中ARGs丰度及分布的重要因素。 [7 Czekalski N, Sigdel R, Birtel J, et al. Does human activity impact the natural antibiotic resistance background? Abun [参考文献] dance of antibiotic resistance genes in 21 Swiss lakes[J]. En- vironment International. 2015.81: 45-55 1秦丽婷童蕾刘慧等.环境中磺胺类抗生素的生物降解及8LuoY, Mao DQ,RyzM,etal. Trends in antibiotic resis 其抗性基因污染现状门环境化学,2016.3565):875-88 tance genes occurrence in the Haihe River, China[]. Envi Qin Liting, Tong Lei, Liu Hui, et al. Biodegradation of sul- ronmental Science and Technology, 2010, 44(19): 7220- fonamides and the pollution characteristics of sulfonamide 7225. resistance genes in the environment([J]. Environment Chem- [9] Ding H, Wu YX, Zhang WH, et al. Occurrence, distrib tion and risk assessment of antibiotics in the surface water [2]隋倩雯张俊亚,魏源送,等.畜禽养殖过程抗生素使用与耐 of Poyang Lake, the largest freshwater lake in China[J] 药病原菌及其抗性基因赋存的研究进展生态毒理学 报,2015,1065:20-34 [10] Zhang XX, Zhang T, Fang HH. Antibiotic resistance Sui Qianwen, Zhang Junya, Wei Yuansong, et al. Veterinary in water environment[J]. Applied Microbiology Biotech- antibiotics use, occurrence of antibiotic resistance pathogen nology,200982(3:397-414. and its antibiotic resistance genes in animal production: an [Il] Mao DQ, Yu s, Rysz M, et al. Prevalence and proliferation overview]. Asia Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 20- of antibiotic resistance genes in two municipal wastewater treatment plants[J]. Water Research, 2015, 85(6): 458-466. 3]罗义周启星.抗生素抗性基因(∽ARGs)——一种新型环境12]冀永般,王雪曾巾,等.南京市湖泊沉积物中重金属垂直分布 污染物环境科学学报,2008,23(8:1499-1505 及污染状况评价门环境科学与技术,2012,3512):230-233. Luo Yi, Zhou Qixing. Antibiotic resistance genes(ARGs)as Ji Yongban, Wang Xue, Zeng Jin, et al. Heavy metal in sedi emerging pollutants[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, ment of urban lakes in Nanjing: vertical distribution and pol lution evaluation[J]. Environmental Science Technology [4] Pruden A, Pei R, Storteboom H, et al. Antibiotic resistance 2012.35(12):230-233
第3期 （2）9 种 ARGs 及 intI1 在武汉城市湖泊均有不同 程度的检出，说明城市湖泊是ARGs的一个重要储库。 其中磺胺类抗性基因 sul1 的相对丰度最高（2.39× 10-2 ~3.99×10-1 ），属于优势抗性基因。 （3）在武汉市3个城市湖泊中，南湖的抗生素总含 量、抗性基因多样性及总相对丰度最高，沙湖和东湖 次之。 （4）intI1 含量与 4 种抗性基因含量（tetG、tetM、 sul1及qnrD）、ARGs总量之间均存在显著正相关关系 （P<0.05），说明intI1是ARGs在城市湖泊环境中进行 水平基因转移的重要媒介。冗余分析表明四环素类、 喹诺酮类抗生素污染和intI1含量是影响湖泊水体、底 泥中ARGs丰度及分布的重要因素。 [参考文献] [1] 秦丽婷,童蕾,刘慧,等. 环境中磺胺类抗生素的生物降解及 其抗性基因污染现状[J]. 环境化学, 2016,35(5):875-883. Qin Liting, Tong Lei, Liu Hui, et al. Biodegradation of sul⁃ fonamides and the pollution characteristics of sulfonamide resistance genes in the environment[J]. Environment Chem⁃ istry, 2016,35(5):875-883. [2] 隋倩雯,张俊亚,魏源送,等. 畜禽养殖过程抗生素使用与耐 药病原菌及其抗性基因赋存的研究进展[J]. 生态毒理学 报, 2015,10(5):20-34. Sui Qianwen, Zhang Junya, Wei Yuansong, et al. Veterinary antibiotics use, occurrence of antibiotic resistance pathogen and its antibiotic resistance genes in animal production：an overview[J]. Asia Journal of Ecotoxicology, 2015,10(5):20- 34. [3] 罗义,周启星. 抗生素抗性基因(ARGs)——一种新型环境 污染物[J]. 环境科学学报, 2008,28(8):1499-1505. Luo Yi, Zhou Qixing. Antibiotic resistance genes(ARGs) as emerging pollutants[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, 28(8):1499-1505. [4] Pruden A, Pei R, Storteboom H, et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in Northern Colora⁃ do[J]. Environmental Science and Technology, 2006,40(23): 7445. [5] 苏建强,黄福义,朱永官. 环境抗生素抗性基因研究进展[J]. 生物多样性, 2013,21(4):481-487. Su Jianqiang, Huang Fuyi, Zhu Yongguan. Antibiotic resis⁃ tance genes in the environment[J]. Biodiversity Science, 2013,21(4):481-487. [6] Zhang QQ, Ying GG, Pan CG, et al. Comprehensive evalua⁃ tion of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science and Technolo⁃ gy, 2015,49(11):6772-6782. [7] Czekalski N, Sigdel R, Birtel J, et al. Does human activity impact the natural antibiotic resistance background? Abun⁃ dance of antibiotic resistance genes in 21 Swiss lakes[J]. En⁃ vironment International, 2015,81:45-55. [8] Luo Y, Mao DQ, Rysz M, et al. Trends in antibiotic resis⁃ tance genes occurrence in the Haihe River, China[J]. Envi⁃ ronmental Science and Technology, 2010, 44(19): 7220- 7225. [9] Ding HJ, Wu YX, Zhang WH, et al. Occurrence, distribu⁃ tion, and risk assessment of antibiotics in the surface water of Poyang Lake, the largest freshwater lake in China[J]. Chemosphere, 2017,184:137. [10] Zhang XX, Zhang T, Fang HH. Antibiotic resistance genes in water environment[J]. Applied Microbiology & Biotech⁃ nology, 2009,82(3):397-414. [11] Mao DQ, Yu S, Rysz M, et al. Prevalence and proliferation of antibiotic resistance genes in two municipal wastewater treatment plants[J]. Water Research, 2015,85(6):458-466. [12] 冀永般,王雪,曾巾,等. 南京市湖泊沉积物中重金属垂直分布 及污染状况评价[J]. 环境科学与技术, 2012,35(12):230-233. Ji Yongban, Wang Xue, Zeng Jin, et al. Heavy metal in sedi⁃ ment of urban lakes in Nanjing: vertical distribution and pol⁃ lution evaluation[J]. Environmental Science & Technology, 2012,35(12):230-233. 肖鑫鑫，等 武汉城市湖泊抗生素及抗性基因的污染特征研究 15
第42卷 ∏3]张瑞泉,应光国,丁永祯,等.广东西枝江-东江流域抗生素 sessment for New Notified Substances and Commission 抗性基因污染特征研究门农业环境科学学报,2013.32 Regulation(EC) No 1488/94 on Risk Assessment for Exist (12):2471-2479 ing Substances[R]. Luxembourg: Office for Official Publica Zhang Ruiquan, Ying Guangguo, Ding Yongzhen, et al. Pol- tions of the European Communities, 2003. lution characteristics of antibiotic resistance genes in Xizhiji- [24] Hernando M D, Mezcua M, Fernandezalba AR, et al. En- ang-Dongjiang river basin, Guangdong Province, China[Jl. vironmental risk assessment of pharmaceutical residues in Journal of Agro -environment Science, 2013, 32(12): 2471 wastewater effluents, surface waters and sediments[J]. T 2479. lanta,2006,9(2):334-342 [14] Zhou L J, Ying GG, Liu S, et al. Simultaneous determina- (25 Yang Y, Chen X, Cao x, et al. Antibiotic resistance genes in tion of human and veterinary antibiotics in various environ- surface water of eutrophic urban lakes are related to heav mental matrices by rapid resolution liquid chromatography ke morphology and anthropic impact electrospray ionization tandem mass spectrometry[]. Jour J]. Ecotoxicology, 2017, 26(6): 831-840 nal of Chromatography A, 2012, 1244(12): 123-138 [26] Lan L, Ke Y, Liang X, et al. Occurrences and distribution of [15] Managaki S, Murata A, Takada H, et al. Distribution of mac- sulfonamide and tetracycline resistance genes in the Yangtze rolides, sulfonamides, and trimethoprim in tropical waters: River Estuary and nearby coastal area[J]. Marine Pollution biquitous occurrence of veterinary antibiotics in the me- Bulletin,2015,100(:304-310 kong delta J]. Environmental Science and Technology, 2007, [27] Jiang L, Hu X, Xu T, et al. Prevalence of antibiotic resis. 41(23):8004-8010 nce genes and their relationship with antibiotics in the 「l6丁惠君钟家有,吴亦潇等.鄱阳湖流域南昌市城市湖泊水 Huangpu River and the drinking water sources, Shanghai, 体抗生素污染特征及生态风险分析门.湖泊科学,2017,29 China[J]. Science of the Total Environment, 2013, 458/459/ (4):848-858. 4603):267-272. Ding Huijun, Zhong Jiayou, Wu Yixiao, et al. Characteris- [28 Yang Y, Liu w, Xu C, et al. Antibiotic resistance genes in tics and ecological risk assessment of antibiotics in five city lakes from middle and lower reaches of the Y angtze river. lakes in Nanchang City, Lake Poyang Catchment([J] Journal China: effect of land use and sediment characteristics[JI of Lake Science, 2017, 29(4): 848-858. Chemosphere, 2017, 178: 19-25 [7 Xu J, Zhang Y, Zhou C, et al. Distribution, sources and com- [29] Stedtfeld R D, Stedtfeld T M, Waseem H, et al. Isothermal position of antibiotics in sediment, overlying water and po assay targeting class I integrase gene for environmental sur water from Taihu Lake, China[J]. Science of the Total Env veillance of antibiotic resistance markers[J. Journal of Envi ronment,2014,497498(3):267-273 ronmental Management, 2017, 198(Pt 1): 213-220 18 Lei X, Lu J, Liu Z, et al. Concentration and distribution [30] Marti E, Variatza E, Balcazar J L. The role of aquatic eco- antibiotics in water-sediment system of Bosten Lake, Xinji systems as reservoirs of antibiotic resistance[]. Trends in ang[J]. Environmental Science Pollution Research Inter- Microbiology, 2014, 22(1): 36-41 national,2015,22(3):1670-8. B31]Hall R M, Collis C M. Mobile gene cassettes and inte ∏刂]章琴琴.北京温榆河流域抗生素污染分布特征及源解析研 grons: capture and spread of genes by site-specific recombi 究[D]重庆:重庆大学,2012 nation(J]. Molecular Microbiology, 2010, 15(4): 593-600 [20]秦延文张雷时瑶等.大辽河表层水体典型抗生素污染特32]李鲁明,袁晓燕,王明义,等.整合子-基因盒系统与细菌 征与生态风险评价门环境科学研究,2015.283):361-368. 耐药机制的研究进展门.中国微生态学杂志,2014,26 Qin Yanwen, Zhang Lei, Shi Yao, et al. Contamination char acteristics and ecological risk assessment of typical antibiot Li Luming, Yuan Xiaoyan, Wang Mingyi, et al. The inte ics in surface water of Daliao River, China[J]. Research of gron-gene cassette system and the mechanism of bacterial Environment Science, 2015, 28(3): 361-3368. drug resistance: research progress[J]. Chinese Journal of Mi- [21]Li W, Shi Y, Gao L, et al. Occurrence of antibiotics in wa- croecology, 2014, 26(2). ter, sediments, aquatic plants, and animals from Baiyangdi- 33] Pei Ruoting, Cha J, And K H C, et al. Response of antibiotic an Lake in North China[]. Chemosphere, 2012, 89(11) resistance genes (ARG)to biological treatment in dairy 1.307-1315 lagoon water[J]. Environmental Science and Technology [22] Yang Y, Cao X, Lin H, et al. Antibiotics and antibiotic resis- 2007,4l(14):5108-5113 tance genes in sediment of Honghu Lake and East Dongting [34] Engemann C A, Keen P L, Knapp C w, et al. Fate of tetracy Lake, China[]. Microbial Ecology, 2016, 72(4): 791-801 cline resistance genes in aquatic systems: migration from the [23] European Commission. Technical Guidance Document in water column to peripheral biofilms[J]. Environmental Sci- Support of Commission Directive 93//67/EEC on Risk As- ence and Technology, 2008, 42(14):5131-5136
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