D0I:10.13374/1.issnl00103.2007.02.045 第29卷第2期 北京科技大学学报 Vol.29 No.2 2007年2月 Journal of University of Science and Technology Beijing Feh.2007 新型胶原支架材料的结构特征与性能 曹成波)吕荣晖)张春莲)邹玉萍) 宋国栋)张长桥) 1)山东大学化学与化工学院，济南2501002)山东大学校医院南区分院，济南250061 3)济南市中心医院，济南250013 摘要为了克服猪脱细胞真皮基质作为组织工程支架材料渗透性差、降解速度过慢、免疫原性较强等缺点，采用多种化学、 生物与物理综合方法处理猪皮制备了一种新型天然胶原支架材料，通过光学显微镜、扫描电镜观察以及体外降解时间、透水 汽性、拉伸强度、孔隙率、收缩温度等的测定，对其性能进行了研究。实验结果显示：支架中的成纤维细胞、脂肪细胞及组织纤 维间质完全去除，胶原纤维得到了松散，并维持其原有的天然三维网络多孔结构：该材料透水汽性处于3000gm一2d一1左右， 适合创面恢复：体外降解时间处于25~50h之间，并可根据需要调整工艺条件控制降解时间：拉伸强度介于10.20~ 11.50MP之间，具有良好的拉伸强度：收缩温度介于70~85℃之间·上述结果表明该材料已解决了猪脱细胞真皮基质渗透 性差、降解速度过慢的缺点，并且其透气性和拉伸强度高、降解性优良且可控，符合组织工程支架材料的要求， 关键词胶原：支架材料；结构特征：性能 分类号Q81 脱细胞真皮基质去除了引发宿主排斥反应的细 物理性能，根据组织工程学原理和猪真皮组织的特 胞成分，完整地保留了细胞外基质的形态结构和组 点，采用多种化学、生物和物理综合方法处理猪皮， 成成分，力学性能好，抗原性低，可诱导具有再生能 制备了一种新型胶原支架材料，为了考察其用作组 力的成纤维细胞、血管内皮细胞按照应有的组织学 织工程支架材料的可能性并为后续研究提供重要的 方式长入真皮层，临床应用效果较好，是目前最有应 基础数据，本文对其进行了结构表征和理化性能的 用前景的真皮支架，其制备方法主要有以下几种： 研究 (1)酶消化法：(2)高渗盐法]；(3)磷酸盐缓 1材料和方法 冲液浸泡法；(4)反复冻融法；(5)氢氧化钠消蚀 法[3]等.目前国内外已经产业化，如美国的A。 1.1材料 derm(Lifecell Coporation)可和我国的桀亚真皮，但 胰酶和1398蛋白酶（山东省沂水酶制剂厂），胶 国内外已上市的产品大多制作过程复杂，产品成本 原酶(Invitrogen,美国)，壳寡糖（济南海得贝海洋生 高，且存在以下缺点：(1)渗透性差，血管化速度 物工程有限公司)，透明质酸钠（山东福瑞达生物化 慢，导致自体皮片复合移植后存活率低门：(2)降解 工有限公司)，戊二醛（中国医药集团上海化学试剂 速度慢，不能被新生组织及时取代，具有“占位 公司)，精密剖层机(GPC300G,泰兴市皮革机械 性[8]；(3)免疫原性较强，局部长期存在炎症免疫 厂)，转鼓（无锡新达轻工机械有限公司），拉力试验 反应[]；(4)生物活性低，不利于细胞的黏附生 机(LJ500型，广州试验仪器厂)，恒温箱(HHS21一4 长)等.以上缺点限制其临床的应用.既要完全去 型，上海跃进医疗器械厂)，扫描电子显微镜(TXA一 除细胞以降低其免疫原性，又要尽可能完整地保留 840,日本电子光学公司)，真空冷冻干燥机（北京博 细胞外基质，同时还要提高其渗透性，采用传统的制 医康实验仪器有限公司)· 备思路和方法难以做到两全其美。本课题组从模拟 1.2方法 天然细胞外基质功能角度出发，综合考虑支架材料 1.2.1新型胶原支架材料的制备8] 取新鲜猪皮，用剖层机取上层，除去皮下组织， 的降解速率、透水汽性、表面生物活性和拉伸强度等 然后进行浸水、脱脂、二次脱脂、滚酶堆置、臀部涂 收稿日期：2006-09-03修回日期：2006-12-05 酶、浸灰、脱灰、浸硝、剖层、修边、称重等预处理，再 基金项目：山东省自然科学基金重点项目(N。·Z2003C01):山东省 用质量分数0.3%~0.5%的胰酶和0.3%~0.5% 科技攻关重点项目(No.031090155):山东大学高层次人才引进科技 专项 的1398蛋白酶处理，并复合壳寡糖，之后用戊二醛 作者简介：曹成波(1965一)：男，教授，博士生导师，博士 交联，并喷涂透明质酸钠溶液，最后真空冷冻干燥
新型胶原支架材料的结构特征与性能 曹成波1） 吕荣晖1） 张春莲2） 邹玉萍1） 宋国栋3） 张长桥1） 1） 山东大学化学与化工学院济南250100 2） 山东大学校医院南区分院济南250061 3） 济南市中心医院济南250013 摘 要 为了克服猪脱细胞真皮基质作为组织工程支架材料渗透性差、降解速度过慢、免疫原性较强等缺点采用多种化学、 生物与物理综合方法处理猪皮制备了一种新型天然胶原支架材料通过光学显微镜、扫描电镜观察以及体外降解时间、透水 汽性、拉伸强度、孔隙率、收缩温度等的测定对其性能进行了研究．实验结果显示：支架中的成纤维细胞、脂肪细胞及组织纤 维间质完全去除胶原纤维得到了松散并维持其原有的天然三维网络多孔结构；该材料透水汽性处于3000g·m －2·d －1左右 适合创面恢复；体外降解时间处于25～50h 之间并可根据需要调整工艺条件控制降解时间；拉伸强度介于10∙20～ 11∙50MPa之间具有良好的拉伸强度；收缩温度介于70～85℃之间．上述结果表明该材料已解决了猪脱细胞真皮基质渗透 性差、降解速度过慢的缺点并且其透气性和拉伸强度高、降解性优良且可控符合组织工程支架材料的要求． 关键词 胶原；支架材料；结构特征；性能 分类号 Q81 收稿日期：20060903 修回日期：20061205 基金项目：山东省自然科学基金重点项目（No．Z2003C01）；山东省 科技攻关重点项目（No．031090155）；山东大学高层次人才引进科技 专项 作者简介：曹成波（1965－）男教授博士生导师博士 脱细胞真皮基质去除了引发宿主排斥反应的细 胞成分完整地保留了细胞外基质的形态结构和组 成成分力学性能好抗原性低可诱导具有再生能 力的成纤维细胞、血管内皮细胞按照应有的组织学 方式长入真皮层临床应用效果较好是目前最有应 用前景的真皮支架．其制备方法主要有以下几种： （1） 酶消化法［1］；（2） 高渗盐法［1－2］；（3） 磷酸盐缓 冲液浸泡法；（4） 反复冻融法；（5） 氢氧化钠消蚀 法［3－4］等．目前国内外已经产业化如美国的 Alloderm （Lifecell Coporation） ［5］和我国的桀亚真皮但 国内外已上市的产品大多制作过程复杂产品成本 高［6］且存在以下缺点：（1）渗透性差血管化速度 慢导致自体皮片复合移植后存活率低［7］；（2）降解 速度慢不能被新生组织及时取代具有“占位 性” ［8］；（3）免疫原性较强局部长期存在炎症免疫 反应［8－11］；（4）生物活性低不利于细胞的黏附生 长［12］等．以上缺点限制其临床的应用．既要完全去 除细胞以降低其免疫原性又要尽可能完整地保留 细胞外基质同时还要提高其渗透性采用传统的制 备思路和方法难以做到两全其美．本课题组从模拟 天然细胞外基质功能角度出发综合考虑支架材料 的降解速率、透水汽性、表面生物活性和拉伸强度等 物理性能根据组织工程学原理和猪真皮组织的特 点采用多种化学、生物和物理综合方法处理猪皮 制备了一种新型胶原支架材料．为了考察其用作组 织工程支架材料的可能性并为后续研究提供重要的 基础数据本文对其进行了结构表征和理化性能的 研究． 1 材料和方法 1∙1 材料 胰酶和1398蛋白酶（山东省沂水酶制剂厂）胶 原酶（Invitrogen美国）壳寡糖（济南海得贝海洋生 物工程有限公司）透明质酸钠（山东福瑞达生物化 工有限公司）戊二醛（中国医药集团上海化学试剂 公司）精密剖层机（GPC 300G泰兴市皮革机械 厂）转鼓（无锡新达轻工机械有限公司）拉力试验 机（LJ－500型广州试验仪器厂）恒温箱（HHS21－4 型上海跃进医疗器械厂）扫描电子显微镜（TXA－ 840日本电子光学公司）真空冷冻干燥机（北京博 医康实验仪器有限公司）． 1∙2 方法 1∙2∙1 新型胶原支架材料的制备［13］ 取新鲜猪皮用剖层机取上层除去皮下组织 然后进行浸水、脱脂、二次脱脂、滚酶堆置、臀部涂 酶、浸灰、脱灰、浸硝、剖层、修边、称重等预处理．再 用质量分数0∙3％～0∙5％的胰酶和0∙3％～0∙5％ 的1398蛋白酶处理并复合壳寡糖之后用戊二醛 交联并喷涂透明质酸钠溶液最后真空冷冻干燥 第29卷 第2期 2007年 2月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol．29No．2 Feb．2007 DOI:10．13374／j．issn1001－053x．2007．02．045
.194 北京科技大学学报 第29卷 经过C。0辐照消毒灭菌，将制备好的材料密封于无 样先在20士2℃的温度下充分浸水，然后使水温逐 菌塑料袋中备用 渐上升，维持2℃min的升温速率，不断轻轻搅动 1.2.2光学显微镜观察14 水，令其缓慢而均匀地流动，直到试样开始收缩，立 (1)HE染色.将待检测试样浸泡在10%甲醛 即记下温度， 溶液中，室温放置24h.随后，每块试样如图1所示 1.2.7体外降解时间的测定] 切取大小为1cm×1cm的两块，分别进行平切、纵 准确称取2mg支架材料置于盛有1.9 mL Tris 切，然后将试样依次用自来水和蒸馏水清洗， CaCl2缓冲溶液(pH7.6)的试管中，然后加入新配 一24℃下冰冻3h.再依次用戊二醛和四氧化饿固 制的2mL(100 Units)胶原酶溶液，将试管置于37℃ 定.将固定处理后的试样切成15~20m的薄片粘 的环境中温育，定时观察，每次三个平行实验，记下 在载玻片一侧，并进行干燥.将干燥好的切片进行 样品完全澄清的时间，取平均值 HE染色，染色处理后的切片在光镜下观察， 2结果与讨论 2.1H亚染色光镜检测 取典型试样进行HE染色光镜观察，比较处理 前后成纤维细胞的脱除情况，根据染色原理可知胶 原纤维呈红色（或粉红色小），细胞呈深褐色（或蓝 紫色).观察结果如下. 图1取样示意图 图2显示，裸皮中存在着很集中的深蓝色物质， Fig.1 Schematic diagram of sampling 根据染色原理其为成纤维细胞成分，周围紫红色的 (2)脂肪染色，将干燥好的切片依次用蒸馏 纤维组织是胶原纤维，该图显示了胶原纤维结构稠 水、70%酒精、苏丹N、70%酒精、蒸馏水处理，最后 密并存在许多成纤维细胞 封固处理，光镜观察封固处理后的切片， 1.2.3扫描电镜观察 将试样切成小块并进行双重固定，清洗，叔丁醇 逐级脱水，真空冷冻干燥脱水和喷金导电处理后，做 水平和垂直切片，扫描电镜观察支架材料表面及内 部的微观结构· 1.2.4透水汽性能的测定1时] 采用类似Aiba法的杯水法测定，取2cm的试 管，装满生理盐水，使膜与液面接触，中间不留空隙， 并沿试管侧面密封称重，得Mo(g),然后将体系放入 36士1℃的干燥器里，24h后称其重，得M1,并测试 图2未经处理的裸皮，平切，HE染色 管的内切面积S(m),透水汽率Rw按下式计算： Fig.2 Unprocessed naked skin,flat cutting.HE dyeing Rw=(Mo-M1)/S (1) 图3和图4显示，试样经处理后，均保留了较完 1.2.5拉伸强度的测定16] 参照GB13022-91.试样在含水量相同的情况 下测定，夹头分离速度大约为100士10 mm'min1, 记下试样断裂时的张力F(N),并测试样的横截面 积S(mm2).拉伸强度Ts用下式计算： Ts=F/S (2) 1.2.6收缩温度的测定16] 用测收缩温度仪测定，检验胶原的交联度，若发 生交联则收缩温度会升高，取样50mmX3mm(试 样厚度小于3mm),如果收缩温度在60℃以下，加 图3处理后试样，平切，HE染色 入烧杯里的水温必须低于收缩温度10℃以上.试 Fig.3 Processed sample,flat cutting.HE dyeing
经过 Co 60辐照消毒灭菌．将制备好的材料密封于无 菌塑料袋中备用． 1∙2∙2 光学显微镜观察［14］ （1） HE 染色．将待检测试样浸泡在10％甲醛 溶液中室温放置24h．随后每块试样如图1所示 切取大小为1cm×1cm 的两块分别进行平切、纵 切．然 后 将 试 样 依 次 用 自 来 水 和 蒸 馏 水 清 洗 －24℃下冰冻3h．再依次用戊二醛和四氧化锇固 定．将固定处理后的试样切成15～20μm 的薄片粘 在载玻片一侧并进行干燥．将干燥好的切片进行 HE 染色．染色处理后的切片在光镜下观察． 图1 取样示意图 Fig．1 Schematic diagram of sampling （2） 脂肪染色．将干燥好的切片依次用蒸馏 水、70％酒精、苏丹Ⅳ、70％酒精、蒸馏水处理最后 封固处理．光镜观察封固处理后的切片． 1∙2∙3 扫描电镜观察 将试样切成小块并进行双重固定清洗叔丁醇 逐级脱水真空冷冻干燥脱水和喷金导电处理后做 水平和垂直切片扫描电镜观察支架材料表面及内 部的微观结构． 1∙2∙4 透水汽性能的测定［15］ 采用类似 Aiba 法的杯水法测定取●2cm 的试 管装满生理盐水使膜与液面接触中间不留空隙 并沿试管侧面密封称重得 M0（g）然后将体系放入 36±1℃的干燥器里24h 后称其重得 M1．并测试 管的内切面积 S（m 2）．透水汽率 RW 按下式计算： RW＝（ M0－ M1）／S （1） 1∙2∙5 拉伸强度的测定［16］ 参照 GB13022－91．试样在含水量相同的情况 下测定夹头分离速度大约为100±10mm·min －1 记下试样断裂时的张力 F（N）并测试样的横截面 积 S（mm 2）．拉伸强度 TS 用下式计算： TS＝F／S （2） 1∙2∙6 收缩温度的测定［16］ 用测收缩温度仪测定检验胶原的交联度若发 生交联则收缩温度会升高．取样50mm×3mm（试 样厚度小于3mm）如果收缩温度在60℃以下加 入烧杯里的水温必须低于收缩温度10℃以上．试 样先在20±2℃的温度下充分浸水然后使水温逐 渐上升维持2℃·min －1的升温速率不断轻轻搅动 水令其缓慢而均匀地流动直到试样开始收缩立 即记下温度． 1∙2∙7 体外降解时间的测定［15］ 准确称取2mg 支架材料置于盛有1∙9mL Tris －CaCl2 缓冲溶液（pH7∙6）的试管中然后加入新配 制的2mL（100Units）胶原酶溶液将试管置于37℃ 的环境中温育定时观察每次三个平行实验记下 样品完全澄清的时间取平均值． 2 结果与讨论 2∙1 HE 染色光镜检测 取典型试样进行 HE 染色光镜观察比较处理 前后成纤维细胞的脱除情况．根据染色原理可知胶 原纤维呈红色（或粉红色［17］ ）细胞呈深褐色（或蓝 紫色［17］ ）．观察结果如下． 图2显示裸皮中存在着很集中的深蓝色物质 根据染色原理其为成纤维细胞成分周围紫红色的 纤维组织是胶原纤维．该图显示了胶原纤维结构稠 密并存在许多成纤维细胞． 图2 未经处理的裸皮平切HE 染色 Fig．2 Unprocessed naked skinflat cuttingHE dyeing 图3 处理后试样平切HE 染色 Fig．3 Processed sampleflat cuttingHE dyeing 图3和图4显示试样经处理后均保留了较完 ·194· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
第2期 曹成波等：新型胶原支架材料的结构特征与性能 195 整的天然胶原纤维三维网络结构，并且未发现有深 分脂肪细胞碎片残留在支架材料中，而图7显示脂 色物质存在，可以初步判断成纤维细胞基本去除 肪细胞完全被去除，由以上的对比可以看出材料中 的脂肪细胞全部破碎，去除较干净 250um 250m 图4处理后试样，平切，E染色 图7处理后试样，纵切，苏丹N染色 Fig.4 Processed sample,flat cutting.HE dyeing Fig.7 Processed sample,vertical cutting,Sudan N dyeing 通过以上照片可以看出：试样中的成纤维细胞 完全被去除，降低了猪皮作为组织工程支架材料的 2.3扫描电镜微观形貌观察 抗原性，同时完整的保留了胶原纤维的天然三维网 图8和图9的扫描电镜结果显示，胶原纤维保 络结构 持良好的天然三维网络结构，截面切片图显示纤维 2.2苏丹V染色光镜观察 束并没有受到破坏，所以有望维持其原有的引导细 取典型试样进行苏丹Ⅳ染色光镜观察，比较处 胞行为的能力，并保持良好的拉伸强度、良好的微观 理前后脂肪细胞的脱除情况，结果见图5~7. 渗透性·剖面切片图清楚地显示了其内部的空洞结 构，说明其具有良好的三维多孔结构 2501m 图5裸皮，纵切，苏丹N染色 Fig-5 Naked skin,vertical cutting,Sudan N dyeing 图8截面SEM图 Fig.8 SEM of vertical section 图6处理后试样，纵切，苏丹W染色 Fig.6 Processed sample,vertical cutting,Sudan N dyeing 图5显示，在裸皮层中部存在着脂肪细胞及组 图9剖面SEM图 Fig.9 SEM of parallel section 织，由图6可以看出脂肪细胞全部破碎，但还有部
整的天然胶原纤维三维网络结构并且未发现有深 色物质存在可以初步判断成纤维细胞基本去除． 图4 处理后试样平切HE 染色 Fig．4 Processed sampleflat cuttingHE dyeing 通过以上照片可以看出：试样中的成纤维细胞 完全被去除降低了猪皮作为组织工程支架材料的 抗原性同时完整的保留了胶原纤维的天然三维网 络结构． 2∙2 苏丹Ⅳ染色光镜观察 取典型试样进行苏丹Ⅳ染色光镜观察比较处 理前后脂肪细胞的脱除情况结果见图5～7． 图5 裸皮纵切苏丹Ⅳ染色 Fig．5 Naked skinvertical cuttingSudan Ⅳ dyeing 图6 处理后试样纵切苏丹Ⅳ染色 Fig．6 Processed samplevertical cuttingSudan Ⅳ dyeing 图5显示在裸皮层中部存在着脂肪细胞及组 织．由图6可以看出脂肪细胞全部破碎但还有部 分脂肪细胞碎片残留在支架材料中．而图7显示脂 肪细胞完全被去除．由以上的对比可以看出材料中 的脂肪细胞全部破碎去除较干净． 图7 处理后试样纵切苏丹Ⅳ染色 Fig．7 Processed samplevertical cuttingSudan Ⅳ dyeing 2∙3 扫描电镜微观形貌观察 图8和图9的扫描电镜结果显示胶原纤维保 持良好的天然三维网络结构．截面切片图显示纤维 束并没有受到破坏所以有望维持其原有的引导细 胞行为的能力并保持良好的拉伸强度、良好的微观 渗透性．剖面切片图清楚地显示了其内部的空洞结 构说明其具有良好的三维多孔结构． 图8 截面 SEM 图 Fig．8 SEM of vertical section 图9 剖面 SEM 图 Fig．9 SEM of parallel section 第2期 曹成波等： 新型胶原支架材料的结构特征与性能 ·195·
.196 北京科技大学学报 第29卷 2.4新型胶原支架材料的物理性能 的体外降解时间增长， 2.4.1透水汽性 表4试样体外降解时间 Queen等认为支架材料的透水汽性差会导致渗 Table 4 In vitro degradation time of samples 出液蓄积的问题，也可能导致健康组织周围浸渍而 戊二醛用量/% 0 0.2 0.4 0.6 引起疼痛18].Wog1认为材料的水汽传递率应控 降解时间h 27.0 34.9 38.7 45.2 制在肉芽创面蒸发量的一半，即2500gm2d1 注：壳寡糖复合量为1%. 左右，这样可以保持创面适当的湿润防止干燥，本 实验制备的试样透水汽性在3000gm-2d一左右， 3 结论 基本属于该范围，由表1可以看出，交联对其透水 本文制备的新型胶原支架材料的原料来源广 汽性影响不大， 泛，制备过程简单，容易实现工业化，通过对其性能 表1试样的透水汽性 检测以及光学显微镜、扫描电镜观察可以得出：支架 Table 1 Permeability of samples 中的细胞脱除彻底，纤维间质去除完全，胶原纤维得 戊二醛用量/% 00.2 0.40.8 到了松散，并维持其原有的天然三维网络多孔结构； 透水汽性/(gm2d) 305330123043 3115 该材料透水汽性处于3000gm-2d一1左右，适合创 面恢复；体外降解时间处于25~50h之间，并可根 2.4.2拉伸强度 据需要调整工艺条件控制降解时间；拉伸强度介于 作为支架材料，要求有一定的机械强度和弹性 10.20~11.50MPa之间：收缩温度介于70~85℃ 以抵抗体内张力，强度太小容易破裂，造成新生组织 之间，这表明该材料已解决了猪脱细胞真皮基质渗 的暴露，影响其保护等功能，复合胶原支架材料由 透性差、降解速度过慢的缺点，透气性和拉伸强度 于其天然网状结构没有破坏，所以它具有很好的拉 高、降解性优良且可控，符合组织工程对支架材料的 伸强度，完全满足临床移植的要求。通过表2的数 要求.以上只是对新型胶原支架材料的主要性能进 据可以看出，所制备的试样的拉伸强度比复合胶原 行了检测，还应进行细胞培养和动物试验，研究其在 膜或纯胶原膜高5~10倍. 生物体内的降解情况及其对创面愈合的影响. 表2试样的拉伸强度 Table 2 Tensile strength of samples 参考文献 胶原膜 纯胶原膜 交联剂戊二醛的用量/% [1】马忠锋，柴家科，杨红明，等.不同方法制备猪脱细胞真皮基质 试样 (0.25%)[(含壳聚糖 及创面移植的实验研究.中国危重病急救医学，2005,17(2)： 8%)5 00.20.40.8 92 拉伸强度/MPa 1.01 2.25 11.3610.7810.2311.04 [2]傅洪滨，霍孟华，张云涛.鼠异体无细胞真皮基质(ADM)的制 备和应用.中国烧伤创疡杂志，2000,4：18 2.4.3收缩温度 [3]夏建春，米立国，高英，等.NaOH消蚀法制备胎儿脱细胞真皮 基质的研究.中国临床解剖学杂志，2005.23(4)：409 由表3可以看出：戊二醛对胶原纤维、壳寡糖产 [4]孙红，车鹏程，王学礼，等.一种新型无细胞真皮基质的研制 生化学交联作用，而且戊二醛交联量越大，新型胶原 解剖学杂志，2003,26(2)：172 支架材料的收缩温度提高幅度越大 [5]Eppley B L.Experimental assessment of the revascularization of 表3收缩温度的测定 acellular human dermis for soft tissue augmentation.Plast Recon- Table 3 Shrinkage temperature of samples str Surg2001,107:757 [6]Wainwright DJ.Use of an acellular allograft dermal matrix (Al- 戊二醛用量/% 0 0.2 0.4 0.8 loderm)in the management of full thickness burns.Burns.1995. 收缩温度/℃70~72 74-75 7879 81-82 21:243 [7]肖仕初，夏照帆，杨强，等。含表皮细胞的无细胞真皮复合皮的 2.5新型胶原支架材料的体外降解性 构建及生长活性研究.解放军医学杂志，2002,27(7)：606 支架材料的降解速率应根据不同细胞的组织再 [8]姜笃银，陈壁，徐明达，等.异种脱细胞真皮基质的制作和临床 生速率而进行调整，新型胶原支架材料经不同程度 应用观察.中华烧伤杂志，2002,18(1)：15 [9]Srivastava A,Desagun EZ.Jennihgs L J.Use of porcine acellular 的交联后，其体外降解时间可控制在比较宽的范围， dermal matrix as a dermal substitute in rats.Ann Surg,2001, 能满足不同产品对支架材料降解速率的不同要求 233(3):400 表4的结果显示，随着戊二醛交联用量的增加，试样 [10]Desagun E Z.Botts J L,Srivastava A.Long term outcome of
2∙4 新型胶原支架材料的物理性能 2∙4∙1 透水汽性 Queen 等认为支架材料的透水汽性差会导致渗 出液蓄积的问题也可能导致健康组织周围浸渍而 引起疼痛［18］．Wong ［19］认为材料的水汽传递率应控 制在肉芽创面蒸发量的一半即2500g·m －2·d －1 左右这样可以保持创面适当的湿润防止干燥．本 实验制备的试样透水汽性在3000g·m －2·d －1左右 基本属于该范围．由表1可以看出交联对其透水 汽性影响不大． 表1 试样的透水汽性 Table1 Permeability of samples 戊二醛用量／％ 0 0∙2 0∙4 0∙8 透水汽性／（g·m －2·d －1） 3053 3012 3043 3115 2∙4∙2 拉伸强度 作为支架材料要求有一定的机械强度和弹性 以抵抗体内张力强度太小容易破裂造成新生组织 的暴露影响其保护等功能．复合胶原支架材料由 于其天然网状结构没有破坏所以它具有很好的拉 伸强度完全满足临床移植的要求．通过表2的数 据可以看出所制备的试样的拉伸强度比复合胶原 膜或纯胶原膜高5～10倍． 表2 试样的拉伸强度 Table2 Tensile strength of samples 试样 纯胶原膜 （0∙25％） ［15］ 胶原膜 （含壳聚糖 8％） ［15］ 交联剂戊二醛的用量／％ 0 0∙2 0∙4 0∙8 拉伸强度／MPa 1∙01 2∙25 11∙3610∙7810∙2311∙04 2∙4∙3 收缩温度 由表3可以看出：戊二醛对胶原纤维、壳寡糖产 生化学交联作用而且戊二醛交联量越大新型胶原 支架材料的收缩温度提高幅度越大． 表3 收缩温度的测定 Table3 Shrinkage temperature of samples 戊二醛用量／％ 0 0∙2 0∙4 0∙8 收缩温度／℃ 70～72 74～75 78～79 81～82 2∙5 新型胶原支架材料的体外降解性 支架材料的降解速率应根据不同细胞的组织再 生速率而进行调整．新型胶原支架材料经不同程度 的交联后其体外降解时间可控制在比较宽的范围 能满足不同产品对支架材料降解速率的不同要求． 表4的结果显示随着戊二醛交联用量的增加试样 的体外降解时间增长． 表4 试样体外降解时间 Table4 In vitro degradation time of samples 戊二醛用量／％ 0 0∙2 0∙4 0∙6 降解时间／h 27∙0 34∙9 38∙7 45∙2 注：壳寡糖复合量为1％． 3 结论 本文制备的新型胶原支架材料的原料来源广 泛制备过程简单容易实现工业化．通过对其性能 检测以及光学显微镜、扫描电镜观察可以得出：支架 中的细胞脱除彻底纤维间质去除完全胶原纤维得 到了松散并维持其原有的天然三维网络多孔结构； 该材料透水汽性处于3000g·m －2·d －1左右适合创 面恢复；体外降解时间处于25～50h 之间并可根 据需要调整工艺条件控制降解时间；拉伸强度介于 10∙20～11∙50MPa 之间；收缩温度介于70～85℃ 之间．这表明该材料已解决了猪脱细胞真皮基质渗 透性差、降解速度过慢的缺点透气性和拉伸强度 高、降解性优良且可控符合组织工程对支架材料的 要求．以上只是对新型胶原支架材料的主要性能进 行了检测还应进行细胞培养和动物试验研究其在 生物体内的降解情况及其对创面愈合的影响． 参 考 文 献 ［1］ 马忠锋柴家科杨红明等．不同方法制备猪脱细胞真皮基质 及创面移植的实验研究．中国危重病急救医学200517（2）： 92 ［2］ 傅洪滨霍孟华张云涛．鼠异体无细胞真皮基质（ADM）的制 备和应用．中国烧伤创疡杂志20004：18 ［3］ 夏建春米立国高英等．NaOH 消蚀法制备胎儿脱细胞真皮 基质的研究．中国临床解剖学杂志200523（4）：409 ［4］ 孙红车鹏程王学礼等．一种新型无细胞真皮基质的研制． 解剖学杂志200326（2）：172 ［5］ Eppley B L．Experimental assessment of the revascularization of acellular human dermis for soft tissue augmentation．Plast Reconstr Surg2001107：757 ［6］ Wainwright D J．Use of an acellular allograft dermal matrix （Alloderm） in the management of ful-l thickness burns．Burns1995 21：243 ［7］ 肖仕初夏照帆杨 等．含表皮细胞的无细胞真皮复合皮的 构建及生长活性研究．解放军医学杂志200227（7）：606 ［8］ 姜笃银陈壁徐明达等．异种脱细胞真皮基质的制作和临床 应用观察．中华烧伤杂志200218（1）：15 ［9］ Srivastava ADesagun E ZJennihgs L J．Use of porcine acellular dermal matrix as a dermal substitute in rats．Ann Surg2001 233（3）：400 ［10］ Desagun E ZBotts J LSrivastava A．Long-term outcome of ·196· 北 京 科 技 大 学 学 报 第29卷
第2期 曹成波等：新型胶原支架材料的结构特征与性能 197. xenogenic dermal mat rix implantation in immunocompetent rats. 型胶原复合膜的制备及性能研究.中国医学物理学杂志， JSurg Res,.2001,96(1):96 2003,20(4):293 [11】姜笃银，陈壁，贾赤宇，等.异种脱细胞真皮基质抗原性的实 16]蒋维棋，皮革成品理化检验北京：中国轻工业出版社， 验研究.中华烧伤杂志，2003,19(3)：155 1999,82 [12]刘德伍，李国辉，邹萍，等.表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞 [17]Chen R N.Ho HO.Tsai Y T,et al.Process development of an 真皮基质构建组织工程皮肤.中国临床康复，2004,8(8)： acellular dermal matrix (ADM)for biomedical applications.Bio- 1439 materials,2004,25,2679 [13]曹成波，吴克安.一种胶原基复合支架材料及其制备方法和用 [18]Queen D.Evans J H.Gaylor J DS,et al.An in vitro assessment 途：中国专利，CN03139063.3.20040908 of wound dressing conformability.Biomaterials.1987.8:372. [14]肖莉莎.Ch4s/胶原杂化活性人工皮肤的研究[学位论文] [19]付小兵，王德文，创伤修复基础.北京：人民军医出版社，1997： 广州：暨南大学，2000：16 282 [15]黄汉萍，牟善松，屠美，等.活性人工皮肤的骨架一一种新 Properties and structure characterization of new type collagen scaffold materials CAO Chengbo),LV Ronghui,ZHANG Chunlian2,ZOU Yuping,SONG Guodong,ZHANG Changgiao 1)Chemistry and Chemical Engineering School,Shandong University,Jinan 250100,China 2)Shandong University Hospital.Jinan 250061,China 3)Jinan Central Hospital.Jinan 250013.China ABSTRACI In order to overcome the shortcomings of acellular dermal matrix used as tissue engineering scaf- fold material,such as bad permeability,low degradation speed,and strong immunogenicity,a new type of colla- gen scaffold was prepared by applying various chemical,biological and physical comprehensive methods to deal with pigskin.The microstructure of the scaffold was observed under photomicroscope and scanning electron mi- croscopy (SEM),and the in vitro degradation time,permeability,tensile-strength,porosity,shrinkage temper- ature were tested.The experimental results show that its dermal fibroblasts,lipocytes and interstitial substances between collagen fibers have been removed completely,simultaneously collagen fibers have been appropriately loosen,and the original natural three-dimensional meshwork porous structure is maintained;the permeability is about 3000g'md which is fit for wound healing:the degradation time is between 25h and 50h and can be controlled by adjusting technological conditions:the tensile-strength is between 10.20 MPa and 11.50 MPa which is better;the shrinkage temperature is between 70C and 85C.All of those indicate that the material overcomes the shortcomings of acellular dermal matrix and has high permeability,tensile"strength,and proper degradation speed.So it conforms to tissue engineering scaffold material requirements. KEY WORDS collagen;scaffold material;structure characterization;properties
xenogenic dermal matrix implantation in immunocompetent rats． J Surg Res200196（1）：96 ［11］ 姜笃银陈壁贾赤宇等．异种脱细胞真皮基质抗原性的实 验研究．中华烧伤杂志200319（3）：155 ［12］ 刘德伍李国辉邹萍等．表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞 真皮基质构建组织工程皮肤．中国临床康复20048（8）： 1439 ［13］ 曹成波吴克安．一种胶原基复合支架材料及其制备方法和用 途：中国专利CN03139063．3．2004－09－08 ［14］ 肖莉莎．Ch4S／胶原杂化活性人工皮肤的研究 ［学位论文 ］． 广州：暨南大学2000：16 ［15］ 黄汉萍牟善松屠美等．活性人工皮肤的骨架－－－一种新 型胶原复合膜的制备及性能研究．中国医学物理学杂志 200320（4）：293 ［16］ 蒋维祺．皮革成品理化检验．北京：中国轻工业出版社 1999：82 ［17］ Chen R NHo H OTsai Y Tet al．Process development of an acellular dermal matrix （ADM） for biomedical applications．Biomaterials200425：2679 ［18］ Queen DEvans J HGaylor J D Set al．An in vitro assessment of wound dressing conformability．Biomaterials19878：372． ［19］ 付小兵王德文．创伤修复基础．北京：人民军医出版社1997： 282 Properties and structure characterization of new type collagen scaffold materials CAO Chengbo 1） LV Ronghui 1） ZHA NG Chunlian 2） ZOU Y uping 1） SONG Guodong 3） ZHA NG Changqiao 1） 1） Chemistry and Chemical Engineering SchoolShandong UniversityJinan250100China 2） Shandong University HospitalJinan250061China 3） Jinan Central HospitalJinan250013China ABSTRACT In order to overcome the shortcomings of acellular dermal matrix used as tissue engineering scaffold materialsuch as bad permeabilitylow degradation speedand strong immunogenicitya new type of collagen scaffold was prepared by applying various chemicalbiological and physical comprehensive methods to deal with pigskin．The microstructure of the scaffold was observed under photomicroscope and scanning electron microscopy （SEM）and the in vitro degradation timepermeabilitytensile-strengthporosityshrinkage temperature were tested．The experimental results show that its dermal fibroblastslipocytes and interstitial substances between collagen fibers have been removed completelysimultaneously collagen fibers have been appropriately loosenand the original natural three-dimensional meshwork porous structure is maintained；the permeability is about 3000g·m －2·d －1which is fit for wound healing；the degradation time is between25h and50h and can be controlled by adjusting technological conditions；the tensile-strength is between10∙20MPa and11∙50MPa which is better；the shrinkage temperature is between70℃ and85℃．All of those indicate that the material overcomes the shortcomings of acellular dermal matrix and has high permeabilitytensile-strengthand proper degradation speed．So it conforms to tissue engineering scaffold material requirements． KEY WORDS collagen；scaffold material；structure characterization；properties 第2期 曹成波等： 新型胶原支架材料的结构特征与性能 ·197·
