新乡医学院教案首页 课程名称 预防医学 授课题目 经口急性毒性试验 授课对象 2012级本科各专业、2014级专升本 1.实验动物称重、编号、分组 20分钟 2. 灌胃（学生操作） 20分钟 3. 中毒体征和动物死亡情况观察 100分钟 时间分配 观察过程中讲： 4.急性毒性试验相关知识 15分钟 5.计算LD(寇氏法)结果分析 15分钟 1.熟悉实验动物的分组与编号方法。 课时目标 2.掌握小鼠灌胃的方法。 3.掌握经口摄入LD50的测定方法。 1 掌握小鼠灌胃的方法 授课重点 2. 经口摄入LD50的测定方法 授课难点 实验动物的分组方法 授课形式 小班实验课教学 授课方法 板书结合示教 1.《卫生学》（第6版） 参考文献 2.《卫生学与流行病学实验指导》 1.动物为什么必须随机分组？ 思考题 2.测定LD时为什么要记录各种中毒现象及时间过程，而不能只记录 死亡只数？ 教研室主任 教研室主任（签字） 课程负责人（签字） 及课程负责 人签字 年月日 年月日
经口急性毒性试验 实验目的 1.熟悉实验动物的编号与分组方法」 2.掌握小鼠灌胃的方法。 3.掌握经口摄入LD的测定方法。 实验内容 随着工业科技的迅猛发展，人类接触的化学品越来越多。这些化学品对人类的健康 造成了一定的威胁。这就需要我们对这些物质进行毒理学安全评价。安全性评价首先是 对化学物质进行毒性鉴定，通过一系列的毒理学试验测试该化学物质对实验动物的毒作 用，从而评价和预测对人体可能造成的危害。完整的毒理学评价通常可划分为四个阶段 的实验研究。第一个阶段急性毒性试验：第二个阶段亚急性毒性试验和致突变试验：第 三个阶段亚慢性毒性试验和代谢试验：第四个阶段慢性毒性试验和致癌试验。 急性毒性试验 急性毒性是指机体（人或实验动物）一次或24h之内多次接触（染毒）外源化学物之 后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应。 急性毒性试验原理 选择健康的实验动物，根据体重，按随机分组的方法，依据LD计算的设计要求将 动物分成数个染毒组。一次或24h内多次给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反 应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的 关系，求出半数致死剂量(LD),并根据LD值将受试物进行急性毒性分级。为进一步 开展该物质的亚急性和慢性毒性实验提供必要的资料。 这次实验课我们来研究农药敌百虫对小鼠的急性毒性作用，用寇氏法计算LD。将 敌百虫农药配制成5个剂量浓度。将36只小鼠分成6组，每组6只。6组小鼠分别接受 5个剂量组，加一个对照组。我们班为一个实验单位，一个实验台为一组，给小鼠染毒， 观察小鼠出现的毒性症状和死亡情况。 操作步骤 1.动物准备 本次试验选取健康小鼠36只，雌雄各半，体重相近，同一批实验动物之间的体重相 差不要超过平均体重的10%。实验前8小时动物禁食 2.实验动物称重、编号 用体重秤称重，记录，精确到克。体重相同或相近的小鼠放在同 个鼠笼。 编号 以染色法编号，用苦味酸（黄色）、品红（红色）的洒精饱和溶 液在动物不同部位被毛上染色标记
用红色表示个位数，黄色表示十位数，可标出1-99号。如标记19号，用红色从 头顶1号、右前肢2号、右腰3号、右后肢4号、尾根5号、左后肢6号、左腰7号 左前肢8、背中9号的顺序标记1~9号。用黄色表示十位，按头顶10号，头顶点一黄 点和一红点表示11，头顶点一黄点，右前肢点一红点表示12，以此类推。举例 3.动物分组： 如何把36只小鼠分成六组？要注意做到随机化，可以用完全随机分组法和随机区组 分组法。这里根据体重按随机区组设计分组，动物按体重从小到大顺序排序，每6只为 一区组，分为6组。把每个区组里的6只动物分到六个剂量组。取随机排列表中任意一 行开始，从这一横行中摘数字1一6，依次填入第一个单位组的各动物号下，舍去其它数 字：再取下一横行中的1至6依次填入第二个单位组各动物号下：依次类推。随机数字 即各动物所属处理组别，分装到六个笼里。 随机数字：《卫生学》P346数字排列表第1行开始 651432、625143、123456、615432、124563、214365 动物分组表（随机区组设计） 体重 编号 随机数字 组号 小鼠编号（体重） 6 4.灌胃 1)染持途径 染毒途径可选用经口染毒、经呼吸道染毒、经皮肤染毒、经注射途径染毒。经口途 径染毒可分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。经口灌胃染毒是急性毒性试验中最常用的 染毒途径。灌胃时将受试物配制成溶液，以注射器经导管注人胃内。利用等容量灌胃法， 即受试物按不同剂量组配制成不同浓度，实验动物单位体 重的灌胃容量相同。 2)灌胃针排气泡，注意读数 3)灌胃量 陶！】小酿的据联
小鼠每10g体重可灌胃0.2ml。计算每只小鼠的灌胃量 4)小鼠灌胃法： 小鼠的抓取方法：右手提起鼠尾，放在鼠笼上面或粗糙桌面上，轻向后拉其尾部， 用左手拇指和食指捏住其头部皮肤及双耳，将小白鼠固定在掌中，使其腹部朝上，然后 以无名指和小指夹住鼠尾。 注意：抓鼠时，防止被小鼠咬伤 左手拇指和食指捏住小鼠耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌将其尾根部 压紧，将小鼠固定成垂直体位，腹部面向操作者。注意使动物的上消化道固定成一直线。 右手持灌胃管，吸取溶液，经口角将灌胃管插入口腔，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食 管。如遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。如遇动物 挣扎，应停止进针或将针拔出，以免穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。药 液注完后轻轻退出胃管。一般小鼠进针深度2.5~4m。 5.中毒体征和动物死亡情况观察 染毒后注意观察毒性体征和死亡情况。高剂量组动物的死亡常很快发生，染毒后应 密切观察。观察和记录中毒体征及出现的时间、死亡时间和数量。根据观察情况分析中 毒特点和毒作用靶器官。填写动物中毒症状记录表《实验指导》p58表14-2 附表啮齿类动物中毒后主要观察的内容 系统和器官 中毒后常见的表现 中枢神经系统与体位异常，叫声异常，活动增多或呆卧少动，肌颜，痉挛，抽搐，麻痹。 神经肌肉系统 后肢无力，运动失调，管状尾，对外界刺反应过敏或迟纯 植物神经系统 瞳孔扩大，流涎，流泪，出汗 呼吸系统 鼻孔溢液，鼻翼扇动，呼吸深缓，呼吸过速，张口或腹式呼吸 泌尿生殖系统 会阴部污秽，有分泌物，阴户或乳腺肿胀，阴茎突出，遗精 皮肤和被毛 皮肤充血、紫绀，被毛蓬松、污秽 眼睛 眼球突出、充血，角膜混浊，血性分泌物 注意：观察时小限放在笼内，不要用手去触摸动物，用玻璃棒 6.计算半数致死剂量（寇氏法） 敌百虫急性毒性实验数据表 剂量(mgkg） 死亡率 组别 药物浓度(% 动物只数 死亡数 mg/kg对数值 p 2.55 5102.7076 6 3.13 6262.797 6 3 3.84 7682.885 6 4.72 9442.975 6 5.80 11603.0645
1ogLD=P.-0.5Xi×∑(P.+P+) 式中R为最大剂量的对数 P,为各组动物死亡率 1为两相邻剂量组的剂量对数差 7.结果与分析 急性毒性试验求出LD值，通过LD值进行急性毒性分级，分级标准见卫生学pl了 表1-3评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小。报告该毒物的LD值和急 性毒性级别外，还应对中毒和死亡特征加以报告。这是因为毒物之间即使在同样实验条 件下的LD相同或相似，但它们的毒性特征、毒作用带或致死剂量范围可明显不同，也 就是说它们的实际毒性有差异。因此，在评价化学毒物的急性毒性时，除LD外，还应 详细描述中毒体征及程度、出现体征的时间、死亡前征兆、死亡的时间和剂量组间分布、 存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化等。 根据实验动物中毒体征、死亡时间和特征、LD,按受试物种类，分别参照相应的 经口急性毒性分组标准进行评定，判断该受试物的毒性大小和毒性特征。 附表化学物质的急性毒性分级小鼠一次经口染毒 毒性分级 剧毒 高毒 中等毒 低毒 微毒 LD50 (mg/kg) 10000 (黄伯俊.农药毒理毒性手册北京：人民卫生出版社，1993,5) 评定：该农药敌百虫的LD为g/kg体重（小鼠，经口），根据毒性分级，属 于低毒。 思考题： 1.动物为什么必须随机分组？ 样本的代表性要求具有同质性，即各处理组和对照组的非实验因素的条件均一致 为此，各实验单位（动物或培养物）的分组及整个实验的全部操作都应遵循随机化原则。 2.什么叫LD?测定LD的意义是什么？ 3.测定D时为什么要记录各种中毒现象及时间过程，而不能只记录死亡只数？ 一接喜理学知识复习 在一定条件下，以较小剂量进入机体就能干扰正常的生化过程或生理功能，引起暂 性或永久性的病理改变，甚至危及生命的化学物质称为毒物(poisor)。但是，毒物与非 毒物之间并没有绝对的界限，使两者之间发生发生的重要条件是剂量。正如毒理学实验 研究的奠基人Paracelsus(1493~1541)所说，所有物质都是毒物，药物和毒物的区别在 于剂量。 毒性(toxicity)是一种物质对机体造成损害的能力。在同等剂量下，对机体损害
能力越大的化学物质，其毒性越高。相对于同一损害指标，需要剂量越小的化学物质， 其毒性越大。如同“毒物”和“非毒物”是相对的一样，化学物质的毒性大小也是相对 的。只要达到一定的剂量水平，化学物质就具有毒性，而如果低于某一剂量水平时，不 具有毒性。因此，剂量是化学物质毒性的决定因素。除了剂量外，毒性还与毒物的接触 途径（消化道、皮肤、呼吸道、其他）、接触方式（一次、多次、间隔长短等）、理化性 质有关。 剂量通常是指机体接触化学物质的量或给予机体化学物质的量，单位是g/kg体重 mg/cm皮肤等。当一种化学物质经由不同途径与机体接触时，其吸收系数与吸收速率各 不相同。因此在提及剂量时，必须说明接触途径。在接触环境污染物时，则根据空气、 水、食品等介质中存在的浓度（分别为g/m,mg/L和mg/kg)乘以进入体内的介质总 量来计算剂量。 毒物毒性的数量概念是通过毒物引起实验动物一定的生物效应的剂量来表示的。常 见的有大剂量毒物进入机体可引起死亡（致死剂量），剂量减少则可能不致死亡而仅仅 引起一系列中毒症状，更小的剂量可能仅仅引起某种微小的功能（生理、生化反应）改 变（阀剂量），如果剂量继续减少则可能不引起可以观察到的变化（无作用剂量）。 MLD 剂敏（或浓度） 致死剂量： 1.绝对致死剂量(absolute lethal dose,,LD,),是指化学物质引起受试对象全部 死亡所需要的最低剂量或浓度。如再降低剂量，就有存活者。但由于个体差异的存在， 受试群体中总是有少数高耐受性或高敏感性的个体，故LDm常有很大的波动性。 2.最小致死剂量(minimal lethal dose,ML,D或LDa):指化学物质引起受试对象 中的个别成员出现死亡的剂量。从理论上讲，低于此剂量即不能引起死亡。 3.最大耐受剂量(maximal tolerance dose,MTD或LD,)指化学物质不引起受试 对象出现死亡的最高剂量。若高于该剂量即可出现死亡。与LDm的情况相似，LD也受 个体差异的影响，存在很大的波动性。 上述LD,和LD常作为急性毒性试验中选择剂量范围的依据。 4.半数致死剂量(median lethal dose,LD)指化学物质引起一半受试对象出现死 亡所需要的剂量，又称致死中量。LD。是评价化学物质急性毒性大小最重要的参数，也 是对不同化学物质进行急性毒性分级的基础标准。化学物质的急性毒性越大，其D的 数值越小。 LD是个生物学参数，受多种因素影响。对于同一种化学物质，不同种属的动物做 感性不同。接触途径不同也可影响LD∞的值。因此，在表示LD时，必须注明动物种属 和接触途径。对于某些化学物质，同种不同性别的功物敏感性不同，对于这样的化学物
质，还应标明不同性别动物的LD。此外，实验室环境、喂饲条件、染毒时间、受试物 浓度、溶剂性质、实验者操作技术的熟练程度等均可对LD产生影响。 LD有较大的波动性，在计算LD时，还要求出95%可信限，以LD士1.960 来表示误差范围。在各种急性毒性分级标准中，等级间的数值一般可相差10倍，就是 充分考虑到LD的波动性 半数致死剂量是每一个动物致死剂量的平均值，它受实验动物个体差异的影响最 小，比较稳定，有代表性，可作为比较毒物毒性大小的重要指标。 阈剂量和最大无作用剂量： 阀剂量(threshdd dose)指化学物质引起受试对象中的少数个体出现某种最轻微 的异常改变所需要的最低剂量，又称为最小有作用剂量(minimal effect level,MEL)。 分为急性和慢性两种：急性阈剂量(acute threhold dose,Limac)为与化学物质一 次接触所得：慢性阙剂量(chronic threshold dose,.Limch。)则为长期反复多次接触 所得。由于实际工作中，在哪个阙剂量水平才能发现化学物质所致的损害作用受到所选 观察指标、检测技术的灵敏度和精确性、试验设计的剂量组数以及每组受试对象数等多 种因素的影响，准确的测定闽剂量是很困难的，故该概念只有理论上的意义。在毒理学 试验中获得的类似参数是观察到损害作用的最低剂量(lowest observed adverse effect level,LOAEL). 最大无作用剂量(maximal no--effect dose,ED0)指化学物质在一定时间内，按 定方式与机体接触，用现代的检测方法和最灵敏的观察指标不能发现任何损害作用的 最高剂量。与阈剂量一样，最大无作用剂量也不能通过试验获得。毒理学试验能够确定 的是未观察到损害作用的剂量(no-observed adverse effect level,NOAEL)。NOAEI 是毒理学的一个重要参数，在制订化学物质的安全限值时起着重要作用。 需要指出的是，对于同一化学物质，在使用不同种属动物、染毒方法、接触时间和 观察指标时，往往会得到不同的LOAEL和NOAEL。因此，在表示这两个毒性参数时应注 明具体实验条件。另外，化学物质的LOAEI和NOEI.不是一成不变的，随着检测手段的 器荞翻器为锁感的观聚指标的发现。这两个诗性参数也会得以更新。 急性毒作用带(acute toxic effect zone,Z)为半数致死剂量与急性阈剂量的比 值，表示为：Ze=LD/儿imc。 乙值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡 的危险性大：反之，则说明引起死亡的危险性小。 慢性毒作用带(chronic toxic effect zone,Za)为急性阈剂量与慢性阈剂量的 比值，表示为：Zh==Lim/Lim 乙值大，说明Lim与Lim,之间的剂量范围大，由极轻微的毒效应到较为明显的中 毒表现之间发生发展的过程较为隐匿，易被忽视，故发生慢性中毒的危险性大：反之
则说明发生慢性中毒的危险性小。 实验目的： 熟悉实验动物的分组与编号方法。 2 掌握小鼠灌胃的方法】 3. 掌握经口摄入LD的测定方法。 实验步骤： 1,实验动物称重、编号、分组 2.灌胃 3.中毒体征和动物死亡情况观察 4.计算LD(寇氏法) 5.结果与分析
