实验四人外周血淋巴细胞分离计数、活力测定密度梯度离心法采用淋巴细胞分离液离心人外周血，根据外周血各细胞体积、形态及比重不同，将离心后呈密度梯度分布的单个核细胞分离出来
实验四 人外周血淋巴细胞分离、 计数、活力测定 采用淋巴细胞分离液离心人外周血， 根据外周血各细胞体积、形态及比重 不同，将离心后呈密度梯度分布的 单个核细胞分离出来。 密度梯度离心法
外周血白细胞分类
外周血白细胞分类
【实验原理】人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为1.075因此选用比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞）淋巴细胞分离液组成聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)
人外周血RBC、粒细胞比重为：1.092 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，比重为 1.075 因此选用比重介于二者之间而近于等渗的淋巴细 胞分离液（比重为1.077±0.001）进行密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯 度分布，从而分离出单个核细胞（淋巴细胞） 【实验原理】 淋巴细胞分离液组成： 聚蔗糖-泛影葡胺 （Ficoll-hypaque）
密度梯度离心示意图
密度梯度离心示意图
【实验材料】1．肝素溶液用生理盐水将肝素配成125~250U/ml的溶液，置4℃下保存备用。2.淋巴细胞分层液市售或自配，20℃时密度应为(1.077±0.001)g/L。3.Hanks液pH 7.2 ~ 7.4。4．完全RPMI-1640培养液5：15ml或50ml锥底离心管6.水平离心机，显微镜7.玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。8.2%台盼蓝染液
1．肝素溶液 用生理盐水将肝素配成125～250 U/ml的溶液，置4℃下保存备用。 2．淋巴细胞分层液 市售或自配，20℃时密度应 为(1.077±0.001)g/L。 3．Hanks液 pH 7.2～7.4。 4．完全RPMI-1640培养液。 5．15 ml或50 ml锥底离心管。 6．水平离心机，显微镜。 7．玻璃吸管，滴管，细胞计数板等。 8．2％台盼蓝染液。 【实验材料】
实验方法1：采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中（每ml全血加0.1ml肝素溶液），立即轻轻摇匀，使血液抗凝。2用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀释。3.吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内
1．采集静脉血3ml，注入盛有肝素的无菌 小瓶中（每ml全血加0.1 ml 肝素溶液），立即 轻轻摇匀，使血液抗凝。 2．用吸管加入等量Hanks液，使血液等倍稀 释。 3．吸取淋巴细胞分离液2ml置于离心管中， 然后将上述稀释血液在距分离液界面上1cm处 沿试管壁缓慢叠加至分离液表面。应注意保持 两界面清晰，勿使血液混入分层液内。 【实验方法】
4.将离心管置水平式离心机内，在18~20下，以2000r/min离心20min，离心后，管内分层如下图所示Qwholedilute plasmadiluted.0defibrinated.00blood血浆血液营6QQQ0lymphocytes+单个核细胞Qcentrifuge2000r/min十分层液30minFicollFicoll细胞分层液多形核白细胞O及红细胞redcellsandPMNs
4．将离心管置水平式离心机内，在18～ 20℃下，以2000 r/min离心20min，离心后， 管内分层如下图所示
5：用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。6：将所得到的单个核细胞悬液用5倍体积的HanK's洗涤，以1500r/min离心10min，弃上清7.混悬细胞，沉淀加1640培养液1ml，摇匀。8.计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液0.9ml，混，静正片刻，在牛鲍氏计数板上冲池，低倍镜下计数外圃四个大格细胞总数×（16×4=64个小方格总数）。实际细胞数/ml=X×10×1000×104
5．用毛细吸管轻轻插入灰白细胞层，沿管壁轻轻吸 出该层单个核细胞，转入另一支离心管中。 6 ． 将 所 得 到 的 单 个 核 细 胞 悬 液 用 5 倍 体 积 的 HanK ’s洗涤，以1500 r/min 离心10 min，弃上清。 7．混悬细胞，沉淀加1640培养液 1ml，摇匀。 8．计数细胞：取0.1ml细胞悬液，加WBC稀释液 0.9ml，混匀，静止片刻，在牛鲍氏计数板上冲池，低 倍镜下计数外围四个大格细胞总数X（16×4=64个小 方格总数）。实际细胞数/ml=Ⅹ×10×1000×10 4
Small squsre =1/400sqmm1/25sq.mm丁WmCoutinggrid (central area)牛鲍氏计数板示意图
牛鲍氏计数板示意图
9.台盼蓝染液检测细胞活力：取2滴细胞悬液于玻片，加2%台盼蓝染液1滴，混匀，铺开，高倍镜镜检。3min内计数完100个细胞，计算存活细胞百分率：（无色），死细胞染成台盼蓝染液检查活细胞不着色蓝色。存活细胞百分率=活细胞数/100个细胞
9．台盼蓝染液检测细胞活力: 取2滴细胞悬液于玻片，加2％台盼蓝染液1滴，混匀， 铺开，高倍镜镜检。3min内计数完100个细胞，计算 存活细胞百分率： 台盼蓝染液检查活细胞不着色（无色），死细胞染成 蓝色。 存活细胞百分率=活细胞数/100个细胞