实验十二质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化 I.质粒DNA的小量制备 一实验目的 学习并掌握质粒的小量制备技术。 二实验材料和用具 菌种：E.coli DH5apUC19 培养基：LB:Tryptone1%,Yeast Extract0.5%,NaCI 19%,pH7.2 (Agar2%):120℃灭菌20min。 D0O01碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品） 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、P管 (Eppendorf管，1.5ml微量离心管入、加样器、吸头等。 三原理 实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱，在特 定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下 又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚 氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。 四实验内容 1.细菌培养及茵体的收获。 2.用试剂盒进行小量质粒制备 五实验步骤 1.将E.co菌株接种到液体LB培养基中，加入氨苄青霉素至100μgml,150rpm振荡16h: 2.吸取1.5ml培养南液与1.5ml离心管中，13000rpm室温下离心2min。倒掉上清，然后 倒置于吸水纸上，使液体流尽：
实验十二 质粒 DNA 的小量制备、电泳检测及细菌转化 Ⅰ. 质粒 DNA 的小量制备 一 实验目的 学习并掌握质粒的小量制备技术。 二 实验材料和用具 菌种：E.coli DH5/pUC19 培养基：LB：Tryptone 1%，Yeast Extract 0.5%，NaCl 1%，pH7.2 (Agar 2%)；120℃灭菌 20min。 D0001 碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品） 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、 EP 管 （Eppendorf 管，1.5ml 微量离心管）、加样器、吸头等。 三 原理 实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱，在特 定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下 又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚- 氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。 四 实验内容 1. 细菌培养及菌体的收获。 2. 用试剂盒进行小量质粒制备。 五 实验步骤 1. 将 E.coli 菌株接种到液体 LB 培养基中，加入氨苄青霉素至 100g/ml，150rpm 振荡 16h； 2. 吸取 1.5ml 培养菌液与 1.5ml 离心管中，13000rpm 室温下离心 2min。倒掉上清，然后 倒置于吸水纸上，使液体流尽；
3.加入150ul溶液I,vortex或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。 4.加入200如溶液Ⅱ，颠倒离心管68次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡： 5.加入500如l溶液Ⅲ，颠倒6-8次，可见白色絮状物产生： 6.13000pm离心10min。离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管 7.直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000pm离心1min,使质粒结合于纯化柱上： 8.倒弃收集管内的液体，在质粒纯化柱内加入750ul溶液V,13000pm离心1mim,洗去 杂质： 9.倒弃收集管内液体，13000pm离心1min,除去残留液体 10.将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加50ul溶液V至管内柱面上，放置1min 11.13000rpm离心1min,所得液体就是质粒。质粒于-20℃冰箱保藏备用。 六注意事项 1.在使用前，在溶液V(洗涤液)加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇，然后在瓶盖 上作好记号。 2.溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再使用。溶 液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。 七思考题 1.加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡 附录一：pUC19图谱
3. 加入 150l 溶液Ⅰ，vortex 或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。 4. 加入 200l 溶液Ⅱ，颠倒离心管 6~8 次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡； 5. 加入 500l 溶液Ⅲ，颠倒 6~8 次，可见白色絮状物产生； 6. 13000rpm 离心 10min。离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管； 7. 直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000rpm 离心 1min，使质粒结合于纯化柱上； 8. 倒弃收集管内的液体，在质粒纯化柱内加入 750l 溶液Ⅳ，13000rpm 离心 1min，洗去 杂质； 9. 倒弃收集管内液体，13000rpm 离心 1min，除去残留液体； 10. 将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加 50ul 溶液Ⅴ至管内柱面上，放置 1min； 11. 13000rpm 离心 1min，所得液体就是质粒。质粒于-20℃冰箱保藏备用。 六 注意事项 1. 在使用前，在溶液Ⅳ（洗涤液）加入 40ml 无水乙醇或 43ml95%乙醇，然后在瓶盖 上作好记号。 2. 溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再使用。溶 液Ⅱ易被空气中的 CO2 酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。 七 思考题 1. 加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？ 附录一：pUC19 图谱
Ⅱ.质粒DNA的电泳检测 一实验目的 学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。 二实验材料 琼脂糖，TAE缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭(EB),标准分子量Marker 电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等 三实验原理 琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化D八NA片段的有效方法。琼脂糖 凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分 离长度20Obp50kb的DNA.。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电 泳。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。 四实验内容 对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测 五实验步骤 1.制胶（见图3） ()胶模两端用胶带封严，架好梳子备用： (2)称取0,2g的琼脂糖于100ml烧杯中，加入20mTAE,加热熔化至无颗粒状琼脂糖 冷却到60℃左右加入EB(终浓度0.5μg/ml),摇匀，即倒入胶模中凝固30min以上： (3)临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液TAE(淹过胶面)， 拔取梳子备用。 2.样品准备 取已提取好的质粒DNA5ul于500ul指管中，加入1ul的加样缓冲液，混匀： 3.电泳 ()将样品和5标准分子质量分别点样到梳孔中：
Ⅱ. 质粒 DNA 的电泳检测 一 实验目的 学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的技术。 二 实验材料 琼脂糖，TAE 缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭（EB），标准分子量 Marker 电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等 三 实验原理 琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段的有效方法。琼脂糖 凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分 离长度 200bp~50kb 的 DNA.。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电 泳。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。 四 实验内容 对所提取的质粒 DNA 样品进行电泳检测。 五 实验步骤 1. 制胶（见图 3） (1) 胶模两端用胶带封严，架好梳子备用； (2) 称取 0.2g 的琼脂糖于 100ml 烧杯中，加入 20mlTAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖， 冷却到 60℃左右加入 EB（终浓度 0.5g/ml），摇匀，即倒入胶模中凝固 30min 以上； (3) 临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液 TAE（淹过胶面）， 拔取梳子备用。 2. 样品准备 取已提取好的质粒 DNA 5l 于 500l 指管中，加入 1l 的加样缓冲液，混匀； 3. 电泳 (1) 将样品和 5l 标准分子质量分别点样到梳孔中；
(2)恒压50v,电泳60分钟左右： (仔)电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。 图3灌制水平琼脂糖凝
(2) 恒压 50v，电泳 60 分钟左右； (3) 电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。 图 3 灌制水平琼脂糖凝胶
六实验结果 将质粒DNA条带与DNA MW Marker进行比对，对质粒提取结果进行分析。 七注意事项 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些 溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。 附录一 溴化乙锭稀溶液的处理 (适用于含有0.5μgml的溴化乙锭的电泳缓冲液) 方法一 1.每100ml溶液中加入2.9 g Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂，可向 Rohm&Haas公司购置： 2.于室温放置12小时，不时摇动： 3.用Whatman 1滤纸过滤溶液，丢弃滤液： 4.用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物予以丢弃。 方法二 1.每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭： 2.于室温放置1小时，不时摇动： 3.用Whatman I号滤纸过滤溶液，丢弃滤液： 4.用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以丢弃。 附录二 1.电泳缓冲液 Tris-乙酸(TAE):0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA。 浓储藏液液(50×TAE):每升含有242 g Tris碱，57.1ml冰乙酸，10ml0.5 mol/LEDTA (pH8.0) 2.0.5mol/L EDTA (pH8.0) 在80ml蒸馏水中加入18.61 g EDTA-Na·2H2O,在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH 调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1000ml,分装后灭菌备用
六 实验结果 将质粒 DNA 条带与 DNA MW Marker 进行比对，对质粒提取结果进行分析。 七 注意事项 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些 溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。 附录一 溴化乙锭稀溶液的处理 (适用于含有 0.5g/ml 的溴化乙锭的电泳缓冲液) 方法一 1. 每 100ml 溶液中加入 2.9g Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向 Rohm & Haas 公司购置； 2. 于室温放置 12 小时，不时摇动； 3. 用 Whatman 1 滤纸过滤溶液，丢弃滤液； 4. 用塑料袋封装滤纸和 Amberlite 树脂，作为有害废物予以丢弃。 方法二 1. 每 100ml 溶液中加入 100mg 粉状活性炭； 2. 于室温放置 1 小时，不时摇动； 3. 用 Whatman 1 号滤纸过滤溶液，丢弃滤液； 4. 用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以丢弃。 附录二 1. 电泳缓冲液 Tris-乙酸（TAE）：0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA。 浓储藏液液（50×TAE）：每升含有 242g Tris 碱，57.1ml 冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0） 2. 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 在 80ml 蒸馏水中加入 18.61g EDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH 调节溶液的 pH 值至 8.0，然后定容至 1000ml，分装后灭菌备用
Ⅲ大肠杆菌的转化实验 一实验目的 学习并掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术 二实验材料和用具 南种：E.coli DH5a 质粒：pUC19: 培养基：LB: 1.LB液体试管：5ml/管 2.LB液体三角瓶：20ml/250ml三角瓶： 3.LB+Amp平板：Ampicillin加量100μgml: 器材：恒温培养箱、恒温摇床、离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、涂布棒、EP 管、 可调移液器、吸头等。 三实验原理 转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。用于转化的受体细胞一般是限制-修饰系统 缺陷的变异株，以防止对外源DNA的切割。质粒能否进入受体细胞取决于该细胞是否处于 容易吸收外源DNA的感受态。细胞的感受态可以通过理化因素诱导产生。大肠杆菌是常用 的受体南，其感受态一般是通过用CaC2在0℃条件下处理细胞而形成。细胞处于0℃的CaC2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，转化混合物中的质粒DNA形成抗 Dnase的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复 合物，在LB培养基上培养数小时后，球形细胞复原并增殖，在选择培养基上便可获得所需 的转化子。 四实验内容 1.制备E.coli DH5a的感受态细胞： 2.进行质粒pUC19的转化
Ⅲ 大肠杆菌的转化实验 一 实验目的 学习并掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术。 二 实验材料和用具 菌种：E.coli DH5； 质粒：pUC19； 培养基：LB： 1. LB 液体试管：5ml/管； 2. LB 液体三角瓶：20ml/250ml 三角瓶； 3. LB+Amp 平板：Ampicillin 加量 100g/ml； 器材：恒温培养箱、恒温摇床、离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、涂布棒、EP 管、 可调移液器、吸头等。 三 实验原理 转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。用于转化的受体细胞一般是限制-修饰系统 缺陷的变异株，以防止对外源 DNA 的切割。质粒能否进入受体细胞取决于该细胞是否处于 容易吸收外源 DNA 的感受态。细胞的感受态可以通过理化因素诱导产生。大肠杆菌是常用 的受体菌，其感受态一般是通过用CaCl2 在0℃条件下处理细胞而形成。细胞处于0℃的CaCl2 低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 Dnase 的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经 42℃短时间热激处理，促进细胞吸收 DNA 复 合物，在 LB 培养基上培养数小时后，球形细胞复原并增殖，在选择培养基上便可获得所需 的转化子。 四 实验内容 1. 制备 E.coli DH5的感受态细胞； 2. 进行质粒 pUC19 的转化
五操作步骤 1.菌种在LB液体培养基中活化，37℃，150rpm振荡培养过夜： 2.转接到新鲜LB液体培养基中，接种量5%： 3.37℃，150rpm培养至0D60o=0.2-0.25: 4.将培养液放入冰浴冷却10min: 5.取1.5ml培养液于6500rpm离心5min,弃上清液： 6.加0.75ml冰冷CaC溶液(50mmol/LCaC2,10mmol/LTris,pH8.0),用混匀器混匀 或用手指弹离心管混匀： 7.将离心管置于冰浴45min: 8.6S00rpm5min离心收集细胞 9.将细胞小心悬浮于0.1ml冰冷CaC,溶液中（用移液器小心混匀）： 10.加1l质粒，小心混匀，置冰浴45min: 11.将离心管置于42℃恒温水浴热处理2min(准确：)： 12.加1mlLB液体培养基后于37℃、150rpm振荡培养1h 13.取0.1ml培养液涂布至LB+Amp平板上： 14.将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。 六实验结果 观察转化结果，并进行分析。 七思考题 1.本实验成功的关键是什么？ 2.什么是感受态细胞，用什么方法获得感受态细胞？ 3.本实验中转化的原理是什么？pUC19质粒有何特点？
五 操作步骤 1. 菌种在 LB 液体培养基中活化，37℃，150rpm 振荡培养过夜； 2. 转接到新鲜 LB 液体培养基中，接种量 5%； 3. 37℃，150rpm 培养至 OD600=0.2~0.25； 4. 将培养液放入冰浴冷却 10min； 5. 取 1.5ml 培养液于 6500rpm 离心 5min，弃上清液； 6. 加 0.75ml 冰冷 CaCl2 溶液（50mmol/LCaCl2，10mmol/L Tris，pH8.0），用混匀器混匀 或用手指弹离心管混匀； 7. 将离心管置于冰浴 45min； 8. 6500rpm 5min 离心收集细胞； 9. 将细胞小心悬浮于 0.1ml 冰冷 CaCl2 溶液中（用移液器小心混匀）； 10. 加 1l 质粒，小心混匀，置冰浴 45min； 11. 将离心管置于 42℃恒温水浴热处理 2min（准确！）； 12. 加 1mlLB 液体培养基后于 37℃、150rpm 振荡培养 1h； 13. 取 0.1ml 培养液涂布至 LB+Amp 平板上； 14. 将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养过夜。 六 实验结果 观察转化结果，并进行分析。 七 思考题 1. 本实验成功的关键是什么？ 2. 什么是感受态细胞，用什么方法获得感受态细胞？ 3. 本实验中转化的原理是什么？pUC19 质粒有何特点？