实验八培养基的制备与灭菌 一、目的要求 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2 掌握培养基的配置方法， 掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代 谢类型的多样性。因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各 有差异。但 般培养基的配制程序却大致相 例如器皿的准备，培养基的配制与分装，桥 塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 三、实验材料 L.药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、Imol/L的NaOH和HC溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭茵锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养 皿、玻璃漏斗等。 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 (一玻璃器皿的洗涤和包装 上.玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的 水中 毛刷刷洗 然后用自来水及蒸馏水冲净 。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自 来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2.灭菌前玻璃器皿的包装 ()培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者 将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才 (2)移液管的包扎：在移 液管的上端塞入一小 段棉花（勿用脱脂棉）， 它的作用是避免外界 及口中杂南进入管内 并防止菌液等吸入口 中。塞入此小段棉花应 距管口约0.5cm左右. 棉花自身长度约 11.5cm。塞棉花时.可 广板 用一外围拉直的曲别 针、将少许棉花塞入管 图81移液管的包扎 口内。棉花要塞得松紧 适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约5m左右的长纸条，然后将己塞好棉花的移液管尖端放在长家 报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管
实验八 培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培养基的配置方法。 3. 掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代 谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各 有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉 塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。 三、实验材料 1. 药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L 的 NaOH 和 HCl 溶液。 2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养 皿、玻璃漏斗等。 3. 其他物品：药匙、称量纸、pH 试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的 水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自 来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者 将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才 能使用。 （2）移液管的包扎：在移 液管的上端塞入一小 段棉花(勿用脱脂棉)， 它的作用是避免外界 及口中杂菌进入管内， 并防止菌液等吸入口 中。塞入此小段棉花应 距管口约 0.5cm 左右， 棉花自身长度约 1~1.5cm。塞棉花时．可 用一外围拉直的曲别 针、将少许棉花塞入管 口内。棉花要塞得松紧 适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约 5cm 左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条 报纸的一端，约成 45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管 图 8-1 移液管的包扎
压紧。在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 (二)液体及固体培养基的配制过程 液体培养基配制 1)称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各 成分的用量。然后进行准确称量。 2)溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水）， 用璃动加热溶 3)定容 待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积 如某种药品用量太少时 可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。 4)调pH:一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹 取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用 1mol1NaoH或1 moVL HC1溶液进行调节。调节nH时，应逐滴加入NaOH或HC溶液， 防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅并， 并不时用pH试纸测试，直至 达到所需H为止 5)过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2.固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂L52%)加 入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去 水分 (三)培养基的分装 根据不同需要，可将己配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾 污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱 脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。 1.试管的分装 取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根檬皮管，橡 皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分 装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试 管内，以右手拇指及食指开放弹爵夹，中指及无名指夹佐玻脑 管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管 大小及需要而定，若所用试管大小为15X150mm时，液体 养基可分装至试管高度1/4左有为宜：如分装固体或半周体 培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制 作斜面的固体培养基的分装量为管高1/5（约3一4m),半固 体培养基分装量为管高的1/3为宜 2.三角瓶的分装 用于振荡培养微生物时，可在250ml三角瓶中加入50ml 图8-2培养基的分装 的液体培养基；若用于制作 平板培养基用时，可在250m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2% 计算)，灭菊时瓶中琼脂粉同时被融化 (四)棉寒的制作及试管、 三角瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试 管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。 1.试管棉塞的制作 制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔
压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （二）液体及固体培养基的配制过程 1．液体培养基配制 1) 称量：一般可用 0.01g 天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各 成分的用量．然后进行准确称量。 2) 溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)， 用玻璃棒搅动，加热溶解。 3) 定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时， 可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。 4) 调 pH：一般用 pH 试纸测定培养基的 pH。用剪刀剪出一小段 pH 试纸，然后用镊子夹 取此段 pH 试纸，在培养基中蘸一下，观看其 pH 范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用 1mol/L NaoH 或 1mol/L HCl 溶液进行调节。调节 pH 时，应逐滴加入 NaOH 或 HCI 溶液， 防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用 pH 试纸测试，直至 达到所需 pH 为止。 5) 过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2．固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加 入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去 水分。 （三）培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾 污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱 脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。 1．试管的分装 取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡 皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分 装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试 管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃 管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管 大小及需要而定，若所用试管大小为 15×150 mm 时，液体培 养基可分装至试管高度 1／4 左有为宜；如分装固体或半固体 培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制 作斜面的固体培养基的分装量为管高 1／5(约 3—4mI)，半固 体培养基分装量为管高的 1／3 为宜。 2．三角瓶的分装 用于振荡培养微生物时，可在 250 m1 三角瓶中加入 50 m1 的液体培养基；若用于制作 平板培养基用时，可在 250 m1 三角瓶中加入 150ml 培养基，然后再加入 3g 琼脂粉(按 2％ 计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。 （四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试 管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。 1．试管棉塞的制作 制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔 图 8-2 培养基的分装
上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞。然后直接压入试管或三角瓶口。也可借 用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。 制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝 以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松 塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。目前也有采 用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。 将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注 明培养基名称及配制日期，灭菌待用。 图83棉寒的制作 图84正确与不正确的棉塞 1,金属塞2正确3、4不正 2.三角瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量， 则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。 在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮 纸并用线绳捆好，灭菌待用。 (五)培养基的灭菌 培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。 (六)斜面和平板的制作 1.斜面的制作 将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成 斜面。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭南后则 应垂直放置至凝固。 2.平板的制作 将装在 角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿 中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多：温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板 平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小 指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾 入1015mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个 平皿中，冷凝后即成平板 )培养基的灭菌检 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1~2管（瓶），置于37℃温箱中培养
上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞．然后直接压入试管或三角瓶口。也可借 用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。 制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松， 塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的 2／3 在试管内，1／3 在试管外。目前也有采 用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。 将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注 明培养基名称及配制日期，灭菌待用。 2．三角瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量， 则可用 8 层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。 在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮 纸并用线绳捆好，灭菌待用。 （五）培养基的灭菌 培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌。 （六）斜面和平板的制作 1．斜面的制作 将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成 斜面。斜面长度不超过试管长度 l／2 为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则 应垂直放置至凝固。 2．平板的制作 将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至 50℃左右倾入无菌培养皿 中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于 50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小 指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾 入 10~15mL 培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个 平皿中，冷凝后即成平板。 （七）培养基的灭菌检查 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出 1~2 管(瓶)，置于 37℃温箱中培养 图 8-3 棉塞的制作 图 8-4 正确与不正确的棉塞 1.金属塞 2 正确 3、4 不正确
12天，确定无菌后方可使用 (八)无菌水的制 在每个250m 的三角瓶内装100mL的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装 4.5mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌。0.1MP阳 灭菊2030min. 五、实验内容 根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎 根据要求配制各种培养 5. 用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭茵。 4. 用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。 六、实验报告 1 简述移液管和培养皿的包扎注意事项。 简述配制培养基的基本步骤及注意事项 3. 为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上瑞均需塞入一小段棉花，再用报纸包 起来，经高压蒸汽灭茵后才能使用 4. 为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞（硅胶塞）才能使用？ 5.配制培养基时为什么要调节H? 6. 高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？ 附录灭菌技术 一、目的婴求 了解消毒和灭茵的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。 二、实验材料 仪器或其他用具：上述包扎的培养皿、试管、移液管等，电热鼓风干燥箱，高压蒸 汽灭菌锅，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，注射器，镊子，玻璃涂棒 培养基：上述配制的培养基及生理盐水 三、基本原理 在微生物实验中，需要讲行纯培养。不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培弟 基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养 体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧 恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭 间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性， 从而达到灭菌的目的。 四、操作步骤 (一)干热灭菌法 干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气(160℃~170℃)进行灭菌，它是利用高 温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管 和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量 越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭 菌所需温度高(160℃-170℃)，时间长(1-2h)。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则， 包器皿的纸或棉塞就会烧焦 ,甚至引起燃烧。 干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。 具体操作步骤如下： 1,装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门
1~2 天，确定无菌后方可使用。 （八）无菌水的制备 在每个 250mL 的三角瓶内装 100mL 的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞。在每支试管内装 4.5mL 蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞。再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌。0.1MPa 灭菌 20~30min。 五、实验内容 1. 根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎。 2. 根据要求配制各种培养基。 3. 用电热鼓风干燥箱对玻璃器皿进行干热灭菌。 4. 用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。 六、实验报告 1. 简述移液管和培养皿的包扎注意事项。 2. 简述配制培养基的基本步骤及注意事项。 3. 为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞入一小段棉花，再用报纸包 起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用? 4. 为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞（硅胶塞）才能使用？ 5. 配制培养基时为什么要调节 pH？ 6. 高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？ 附录 灭菌技术 一、目的要求 了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。 二、实验材料 1. 仪器或其他用具：上述包扎的培养皿、试管、移液管等，电热鼓风干燥箱，高压蒸 汽灭菌锅，微孔滤膜过滤器，0.22μm 滤膜，注射器，镊子，玻璃涂棒。 2. 培养基：上述配制的培养基及生理盐水 三、基本原理 在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必须对所用器材、培养 基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物，包括微生物的营养 体、芽孢和孢子。实验室常用的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、 间歇灭菌、煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性， 从而达到灭菌的目的。 四、操作步骤 （一）干热灭菌法 干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160℃~170℃）进行灭菌，它是利用高 温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管 和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量 越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭 菌所需温度高（160℃~170℃），时间长（1~2h）。但干热灭菌温度不能超过 180℃，否则， 包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 干热灭菌使用的是电热干燥箱（干燥箱）。 具体操作步骤如下： 1. 装入待灭菌物品：将包好的待灭菌物品放入电热干燥箱内，关好箱门
堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭茵物品不要接触电热 干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。 2. 老通电源 ,打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器。 温度逐步上升 当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中， 如果红灯炮灭， 灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160℃~170℃，则需要转 动温度调节器使红打亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。 3相温：当温度升到160℃10C时，借助相温调节器的自动梯制，保持出温度h。于热 灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故 4. 降温：切断电源， 自然降温 5.开箱取物：待电热干操箱内温度峰到60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时 应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到60℃以前，切勿 自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂 (二)高压蒸汽灭菌 高压恭汽灭菌 是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在 一定的压力下保持15~30分钟 进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌， 将待灭菌的物品放在 一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭茵锅夹套间的水沸腾而 产生蒸汽。待水蒸汽急刷地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热， 此时由干蒸汽不能出，而增加了灭菌锅内的压力，从而伸沸点增高，获得高于100℃的温 度，导致茵体蛋白质凝固变性 达到灭菌的日的 在相同的温度下 ,湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：在湿热灭菌中菌体吸收 水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低：湿热灭菌中燕 汽的穿透力比干燥空气大：蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提 高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。 实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原 理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考 家说明书。具体操作步骤如下： 1加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角 搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故 装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影 响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶 壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。 3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口， 然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。 4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。 般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟 升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热， 锅内压力开始上升 6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。 如本实验中采用0.1Mpa,121.5℃，20分钟灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气 阀，维持所需压力 7 降压：达到灭菌所需的时间后 切断电源，让灭茵锅温度自然下降，当压力表的压力 至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品 倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开样气阀，开盖取物。否则就会因锅 内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶
堆积时要留有空隙，物品不要摆放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电热 干燥箱内壁的铁板、温度探头，以防包装纸烤焦起火。 2. 升温：接通电源，打开开关，适当打开电热干燥箱顶部的排气孔，旋动恒温调节器，使 温度逐步上升。当温度升至 100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿 灯亮，表示电热干燥箱内停止加温，此时如果还未达到所需的 160℃~170℃，则需要转 动温度调节器使红灯亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。 3. 恒温：当温度升到 160℃~170℃时，借助恒温调节器的自动控制，保持此温度 2h。干热 灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。 4. 降温：切断电源，自然降温。 5. 开箱取物：待电热干燥箱内温度降到 60℃以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。同时， 应将温度调节旋钮调到零点，并打开排气孔。电热干燥箱内温度未降到 60℃以前，切勿 自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 （二）高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压力下保持 15~30 分钟 进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅夹套间的水沸腾而 产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热， 此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于 100℃的温 度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：在湿热灭菌中菌体吸收 水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸 汽的穿透力比干燥空气大；蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提 高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。 实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭菌锅，其结构和工作原 理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂 家说明书。具体操作步骤如下： 1. 加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角 搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。 2. 装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影 响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶 壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。 3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口， 然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。 4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。 一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需 5 分钟。 5. 升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。 6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。 如本实验中采用 0.1Mpa，121.5℃，20 分钟灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气 阀，维持所需压力。 7. 降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降 至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品， 倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅 内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶
口被污染，甚至均伤操作者。 8.无菌检查：将己灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h,检查无杂菌生长后，即可 使用 (三)过滤除南 有些物质，如抗生素、血清、维生素、糖溶液等采用加热灭茵法时，容易受热分解而被 破坏，因而要采用过滤除菌法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法，该 法 大的优点是不破坏溶液中各种物质的化 分 过滤除菌法除实验室用于溶 ,试 的除菌外，在微生物工作中使用的净化工作台也是根据过滤除菌的原理设计的，可根据不同 的需要来选用不同的滤器和滤板材料。 应用最广泛的过滤黑种类有： 1. 微孔滤膜过滤器：是一种新型过滤器，它由上下二个分别具有出口和入口连接装置的理 料盒组成。 出口处可连接针头， 入口处可连接针筒 使用时将滤膜装入两塑料盒之间 旋系盒， 当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和 分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成 的薄膜，有孔径大小不同的多种规格（如0.1μm、0.22μm、0.3um、045um等），实验 室中用于除菌的微孔波膜孔径一般为022um。根据待除南溶液量的多少，可选用不同 大小的滤器。该滤器的代占是吸附性小，即溶液中的物质损少。时滤速度快。每张 膜只使用1 不用清洗 2. 蔡氏(Si也)过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其 他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对 溶液中其他物质的吸附性也大，每张纤维板只能使用1次。 玻璃过滤器：是一种破璃制成的过油漏斗，其讨油部分是由细玻璃粉烧结成的板状构浩 玻璃滤器的规格很多，5号（孔径2 )和6号（孔径<2um 适用于过滤细菌， 优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用 本实验采用微孔滤膜过滤器进行过滤除菌，具体操作步如下： 1 组装、灭菌：将0.22孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌 后待用(01na.1215℃.灭菌20分钟) 连接：将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器 ,将针 头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中 3. 压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。 压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。 4. 无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液0.1L于肉汤蛋白陈平板上，均匀涂布，置37℃恒 温培养箱培养24小时，检查是否有杂菌生长。 5. 清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜 将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜 组装包扎，再经灭菌后使用。 整个过程应亚格按照无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象
口被污染，甚至灼伤操作者。 8. 无菌检查：将已灭菌的培养基放入 37℃恒温培养箱培养 24h，检查无杂菌生长后，即可 使用。 （三）过滤除菌 有些物质，如抗生素、血清、维生素、糖溶液等采用加热灭菌法时，容易受热分解而被 破坏，因而要采用过滤除菌法。过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法，该 方法最大的优点是不破坏溶液中各种物质的化学成分。过滤除菌法除实验室用于溶液、试剂 的除菌外，在微生物工作中使用的净化工作台也是根据过滤除菌的原理设计的，可根据不同 的需要来选用不同的滤器和滤板材料。 应用最广泛的过滤器种类有： 1. 微孔滤膜过滤器：是一种新型过滤器，它由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑 料盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盒之间， 旋紧盒盖，当溶液从针筒注入滤器时，各种微生物被阻留在微孔滤膜上面，而液体和小 分子物质通过滤膜，从而达到除菌的目的。其滤膜是由硝酸纤维素、醋酸纤维素等制成 的薄膜，有孔径大小不同的多种规格（如 0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm 等），实验 室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为 0.22μm。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同 大小的滤器。该滤器的优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗少，过滤速度快，每张滤 膜只使用 1 次，不用清洗。 2. 蔡氏（Seitz）过滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其 他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对 溶液中其他物质的吸附性也大，每张纤维板只能使用 1 次。 3. 玻璃过滤器：是一种玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。 玻璃滤器的规格很多，5 号（孔径 2~5μm）和 6 号（孔径<2μm）适用于过滤细菌，其 优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。 本实验采用微孔滤膜过滤器进行过滤除菌，具体操作步骤如下： 1. 组装、灭菌：将 0.22µm 孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌 后待用（0.1Mpa，121.5℃，灭菌 20 分钟）。 2. 连接：将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器 上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。 3. 压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。 压滤时用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。 4. 无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液 0.1mL 于肉汤蛋白胨平板上，均匀涂布，置 37℃恒 温培养箱培养 24 小时，检查是否有杂菌生长。 5. 清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜， 组装包扎，再经灭菌后使用。 整个过程应严格按照无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象