实验操作-临床样本的处理和组织总RNA的提取临床血液样本的处理和组织总RNA的提取华丽Slide1上潘文通大学
Slide 1 临床血液样本的处理和组 织总RNA的提取 华丽
1.实验目的掌握临床血液样本的预处理。完整RNA的提取和纯化，是进行RNA方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、CDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从组织中提取和纯化总RNA的方法。Slide2上海文通大学
Slide 2 1.实验目的
2.实验操作内容>临床血液样本的预处理>组织总RNA的提取、纯化和测定Slide3上海文通大学
Slide 3 2. 实验操作内容
3.临床血液样本的处理步骤>接收临床血液样本，附样本信息单（包含流水号，姓名，身份证号）>核对临床血液样本流水号：每个研究对象采集2管抗凝血，血液量（4-5ml），记录血液样本量，分为缺失、1-3ml、4-6ml（3个级别），做好标记>按流水号顺序排列，离心，4℃，1200转/分，20分钟；血液分层为上层血浆，中间层白细胞和血小板，下层红细胞；每（白色管份血液分装为2管血浆（黄色管盖），1管白细胞盖），2管红细胞（红色管盖）Slide4上海文通大学
Slide 4 3. 临床血液样本的处理步骤
3.临床血液样本的处理步骤>冻存管入盒，准备10份冻存盒（血浆1，血浆2，血浆3，血浆4，白细胞1，白细胞2，红细胞1，红细胞2，红细胞3，红细胞4），10管分别入盒，每盒存放81个样本（9行*9列），>冻存盒正面及正侧面分别做好记录（记录内容为：总编号，**年**月**日，****社区**样本第*管，流水号**一一一**，例如：1编号，2016年04月13日，天山社区血浆样本第1管，1-81号标本）>所有样本及时放入-80℃冰箱，原则上相同社区的样本存放在同一个冰箱，血液样本存放示意图，入库Slide5上海文通大学
Slide 5 3. 临床血液样本的处理步骤
4.临床血液样本的处理步骤示意图分层离心，1200rpm/min，20min血液的组成BW血浆（55%)血液白细胞分装入库血小板血细胞(45%)红细胞Slide6上海文通大学
Slide 6 4. 临床血液样本的处理步骤示意图 离心，1200rpm/min，20min 分装 分层 入库
5.组织总RNA提取和纯化步骤样品处理>用DEPC水浸泡过的剪刀剪取小鼠肺组织30mg左右（约半粒米大小），放入含有1mlTrizol试剂和磁珠的离心管中；>将EP管放进研磨机中进行研磨，按照90HZ的频率研磨1分钟，连续研磨7次，间隔时间为1分钟。>取出研磨好的离心管，放入离心机中按照3000rpm/min的速度离心1分钟，小心吸出上层匀浆到另一新的1.5ml离心管Slide7上潘文通大学
Slide 7 5. 组织总RNA提取和纯化步骤 样品处理 Ø 用DEPC水浸泡过的剪刀剪取小鼠肺组织30mg左右（约半粒 米大小），放入含有1ml Trizol试剂和磁珠的离心管中； Ø 将EP管放进研磨机中进行研磨，按照90HZ的频率研磨1分钟， 连续研磨7次，间隔时间为1分钟。 Ø 取出研磨好的离心管，放入离心机中按照3000rpm/min的速 度离心1分钟，小心吸出上层匀浆到另一新的1.5ml离心管
5.组织总RNA提取和纯化步骤按0.2ml氯仿/1mlTrizol加入氯仿（1：5）（本实验加200μ1），（注意：此步振荡非常重要，剧烈振荡混匀后室温放置10min。建议在旋涡振荡器上进行振荡15ses，室温放置5min。）4℃，12.000g离心15min。离心管中的样品分为三层：底层为黄色（红）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60%。吸取上层水相，至另一离心管（RNAfree）中。一般300-350μl就足够了（一般300ul），宁少勿多！（注意：千万不要吸取中间界面）加入等体积预冷的异丙醇（300ul），混匀，室温放置10min。Slide8上海文通大学
Slide 8 5.组织总RNA提取和纯化步骤
5.组织总RNA提取和纯化步骤4℃12,000g离心10min，弃上清，高离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。按0.5ml75%乙醇/1mlTrizol加入预冷的75%乙醇（500ul）洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉（切勿触及沉淀！）淀。4℃12,000g离心5min，尽量弃上清（重复一次！）室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min，尽可能使乙醇挥发。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。加入20ul无RNase的水，充分震荡混匀。Nanodrop核酸测定仪测定核酸浓度Slide9上海文道大学
Slide 9 Ø 4℃ 12,000g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底出现 胶状沉淀。 Ø 按0.5ml 75%乙醇/1ml Trizol加入预冷的75%乙醇（500ul） 洗涤RNA沉淀，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉 淀。 Ø 4℃ 12,000g离心5min，尽量弃上清（重复一次！）。 Ø 室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min，尽可能使乙醇挥发。 （注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。） Ø 加入20μl无RNase的水，充分震荡混匀。 Ø Nanodrop核酸测定仪测定核酸浓度 5.组织总RNA提取和纯化步骤
6.操作步骤示意图按90HZ的频率，每次1min3000转,1min剪取30mg肺组织(1)共研磨7次，直至裂解液中加1mlTrizol(2)取匀浆无明显沉淀4℃,12000g盖紧离心管盖漩涡振荡15s向裂解液中离心15min(4)加200μ氯仿(3)室温静置10min吸取上清液300μ上下颠倒离心管充分混匀向上清中加入等体积至另一新离心管中(6)(5)室温静置10min预冷的异丙醇混匀（切忌吸出白色中间层）轻轻上下颠倒小心弃去上清缓慢沿离心管壁4℃，12000g离心10min洗涤离心管壁(8加入500μl75%乙醇(7)4℃，12000g离心5min加入20μlRNase-free水室温干燥沉淀3-5min小心尽量弃去乙醇溶解沉淀备用(9)Slide10上海文通大学
Slide 10 剪取30 mg肺组织， 加1ml Trizol 按90HZ的频率，每次1min， 共研磨7次，直至裂解液中 无明显沉淀 向裂解液中 加200 μl氯仿 4℃, 12000g 离心15min 吸取上清液300 μl 至另一新离心管中 (切忌吸出白色中间层) 向上清中加入等体积 预冷的异丙醇混匀 4℃, 12000g 离心10min 缓慢沿离心管壁 加入500μl 75%乙醇 4℃, 12000g 离心5min 小心尽量弃去乙醇 加入20μl RNase-free水 溶解沉淀备用 3000转,1min 盖紧离心管盖，漩涡振荡15s 室温静置10min 上下颠倒离心管充分混匀 室温静置10min 小心弃去上清 室温干燥沉淀3-5min （1） 取匀浆（2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9） 洗涤离心管壁 轻轻上下颠倒 6. 操作步骤 示意图