甲基化2018
甲基化 2018
甲基化定焦磷酸测量序聚合酶链式反应亚硫酸(PCR)盐转化基因组DNA提取
基因组 DNA 提取 亚硫酸 盐转化 聚合酶链 式反应 （PCR ） 焦磷酸测 序 甲基化定 量
基因组DNA提取>试剂盒：基因组DNA小量抽提试剂盒（离心柱式）一碧云天>可以抽提动物组织、鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、动物血液、昆虫以及固定组织的包括基因组DNA在内的总DNA。产品编号产品名称包装10mlD0063-1样品裂解液AD0063-2样品裂解液B11ml洗漆液D0063-321ml（篇一次使用前加入7ml无水乙醇）R统租D0063-4洗涤液16ml（第一次使用前加入24ml无水乙醇）洗脱液22mlD0063-5蛋白醇K1.1mlD0063-6D0063-7DNA纯化柱及废液收集管50套说明书1份
基因组DNA提取 试剂盒：基因组DNA小量抽提试剂盒(离心柱式)—碧云天 可以抽提动物组织、鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、动物血液、 昆虫以及固定组织的包括基因组DNA在内的总DNA
a.收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200微升PBS中。b.清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升100mg/mlRNaseA，Vortex混匀。室温(15-25)放置2分钟。c.加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。d.加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。e.加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。f.把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g（约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。g.加入500微升洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。h，加入600微升洗涤液II，≥18000g（约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。i.再≥18000g（约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。j.将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA
a. 收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200微升PBS中。 b. 清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4微升 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15- 25ºC)放置2分钟。 c. 加入20微升蛋白酶K，Vortex混匀。 d. 加入200微升样品裂解液B，Vortex混匀。70ºC孵育10分钟。 e. 加入200微升无水乙醇，Vortex混匀。 f. 把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g (约≥8000rpm)离心1分钟。 倒弃废液收集管内液体。 g. 加入500微升洗涤液I，≥6000g (约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液 体。 h. 加入600微升洗涤液II，≥18000g (约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内 液体。 i. 再≥18000g (约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。 j. 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5ml离心管上，加入50-200微升洗脱液。室温放 置1-3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA
亚硫酸盐转化>试剂盒:EpiTectPlus DNABisulfiteKit---QIAGEN>适用于血液、细胞、组织和石蜡包埋的组织。WholeCulturedcellsFFPEbloodortissuesfissuesEpiTectPlusLyseAll BisulfiteKitEpiTectPlusFFPEBisulfiteKitEpifeuPlusFepKo (48)DNABisulfiteconvertedDNA
亚硫酸盐转化 试剂盒：EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit-QIAGEN 适用于血液、细胞、组织和石蜡包埋的组织
EpiTectBisulfite ConversionProcedure亚硫酸盐转化DNAand EpiTectBisulfite reactionreaction buffersDNAconversioninthermal cycler (5h)Transferto1.5mlmicrofubeAddBufferBLWCm-DLoadSpinColumnBindffffWashAddBufferBW纯化DesulfonationAdd Buffer BDWash (x 2)AddBufferBWElute
亚硫酸盐转化纯化
DNA亚硫酸盐转化1.Add8o0μl RNase-freewaterto eachaliguotof BisulfiteMixneeded,andvortex until Bisulfite Mix is completely dissolved. This may take up to 5 min.Dissolving the Bisulfite Mix may require heating the solution to 60°C.2.Set up the bisulfite reactions in 200 μl PCR tubes according to Table 1.AddeachcomponentintheorderlistedTable1.BisulfitereactionsetupHigh concentration samplesLowconcentrationsamples(1 ng - 500 ng)(1ng - 2 μg)ComponentVolumeper reaction (μl)Volumeper reaction (μl)DNA solutionVariablet (maximum40 μl)Variable*(maximum20μl)VariabletVariable*RNase-free water8585Bisulfite Mix3515DNAProtectBuffer140140Totalvolume*ThecombinedvolumeofDNA solutionandRNase-freewatermusttotal2Oμl.tThe combined volumeof DNA solution and RNase-free water must total 40 μl
DNA亚硫酸盐转化
DNA亚硫酸盐转化3.ClosethePCRtubes andmixthebisulfitereactionsthoroughly.DNAProtectBuffer should turn blue indicating sufficient mixing and correct pH.4.Programthethermal cycleraccordingtoTable2.Useacyclerwithaheated lid.Ifusingathermal cyclerthatdoesnotallowyoutoenterthereactionvolume(140μl),settheinstrumenttothelargestvolume settingavailable.Table2.BisulfiteconversionthermalcyclerconditionsStepTimeTemperature95℃5 minDenaturation60℃Incubation25 min5 min95℃Denaturation60℃Incubation85min(1h25min)95℃Denaturation5min60℃Incubation175min(2h55min)Hold20℃Indefinite*
DNA亚硫酸盐转化
DNA纯化1.For startingmaterial<10OngDNA,adddissolvedcarrierRNAtoBufferBL.Prepareonlythe amountneeded forthe numberof reactions (Table1)2.Upon completionof thebisulfite conversion (Protocol 1),brieflycentrifugethePCRtubes.Transferthereactionstoclean1.5ml microcentrifugetubes3.Add310ulBufferBL(with10μg/mlcarrierRNAfor<100ngDNA;step1toeach sample.Mixbyvortexing andthen centrifugebriefly4.Add 250 μl ethanol (96-100%) to each sample.Mix by pulse vortexing for15sandthencentrifugebrieflytoremovedropsfrominsidethelid.5.PlaceMinElute?DNA spin columns and collectiontubes inarack.Transferthe entire contents of eachtube (step 4)to a corresponding spin column.6.Centrifugethespincolumnsatmaximumspeedfor1min.Discardtheflow-throughandplacethespin columns backintothecollectiontubes
DNA纯化
Table1.CarrierRNAandBufferBLvolumes148162448Numberofsamples1.4 ml2.8 ml5.6 ml8.4 ml16.8 mlVolumeof BufferBL*350μl84 μl3.5 μl14 μl28 μl56 μl168 μlVolumeofcarrierRNAsolution**Volumesgive10μg/mlcarrierRNAinBufferBLwitha10%surplusforpipettinginaccuracies