分子流行病学实验课--荧光实时定量PCR2018
2018
d常用核酸标志物的检测技术>实时定量PCR技术>DNA甲基化检测技术>基因芯片技术>变性高效液相色谱检测技术>原位杂交技术>SNP检测技术>DNA测序技术
Ø实时定量PCR技术 ØDNA甲基化检测技术 Ø基因芯片技术 Ø变性高效液相色谱检测技术 Ø原位杂交技术 ØSNP检测技术 ØDNA测序技术 常用核酸标志物的检测技术
PCR视频（2分24秒视频）
PCR视频（2分24秒视频）
PCR技术反应原理PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右）DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链
PCR技术反应原理
23重复1~3步高温变性适温延伸低温退火25~30轮94目的DNA片段温扩增100万倍以上度形成2条单链72DNA变性(℃)子链延伸DNA加倍55DNA单链与引物复性DNA双螺旋2213245时间（min）
PCR技术反应体系·引物（如何设计？）·酶：TaqDNA聚合酶缓冲液：Mg2+1~3mmol/LdNTP：4种dNTP终浓度各100~250μmol/L·模板：DNARNA
PCR技术反应体系
PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5端引物和3'引物设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5端引物与位于待扩增片段5'端上的一小段DNA序列相同；03端引物与位于待扩增片段3端的一小段DNA序列互补
PCR引物设计
PCR引物设计原则（1）引物长度：15-30bp，常用为20bp左右引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧密啶核苷酸的成串排列参照引物内部不应出现互补序列两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3端的互补重叠
PCR引物设计原则（1）
PCR引物设计原则（2）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3'未端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3'端的碱基，特别是最未及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。如附加限制酶位点，引入0引物的5端可以修饰荧光物质、地高辛标记，突变位点，用生物素、加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等
l引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不 能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 l引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基 ，应严格要求配对，最佳选择是G和C。 l引物的5’端可以修饰。如附加限制酶位点，引入 突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记， 加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子 等。 PCR引物设计原则（2）
PCR引物设计软件Primer Premier5.0vOligo6yVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3
PCR引物设计软件