临床组织样本western blotting2018
临床组织样本 western blotting 2018
临床组织样本处理对蛋白质进行定量Western Blotting
临床组织样本处理 对蛋白质进行定量 Western Blotting
临床组织样本处理1.临床组织样本包括心肝牌肺肾以及脑组织等，由于血液中成分比较复杂，为避免其对结果的影响，在收集样本时需要将组织中的血液尽量排尽；2.将组织至于研钵中，用剪刀将组织尽量剪碎，再放入适量的液氮，并迅速用钵杆研磨组织，用RIPA裂解液裂解组织。对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1mlRIPA裂解液，肺100~200mg加1mlRIPA裂解液。可用移液器反复吹打，或者将组织和裂解液的混合液放在振荡器上振荡以组织得到充分裂解。过程中须尽量保持低温，快速操作。3.裂解后，将裂解液移1.5ml离心管中，于4℃离心机中，12000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存（-80℃长期保存）
临床组织样本处理 1. 临床组织样本包括心肝脾肺肾以及脑组织等，由于血液中成分比较复杂，为 避免其对结果的影响，在收集样本时需要将组织中的血液尽量排尽； 2. 将组织至于研钵中，用剪刀将组织尽量剪碎，再放入适量的液氮，并迅速用 钵杵研磨组织，用RIPA裂解液裂解组织。对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加 1ml RIPA裂解液，肺100~200mg加1ml RIPA裂解液。可用移液器反复吹打，或者 将组织和裂解液的混合液放在振荡器上振荡以组织得到充分裂解。过程中须尽量 保持低温，快速操作。 3. 裂解后，将裂解液移1.5ml 离心管中，于4℃离心机中，12000rpm离心20min， 取上清分装于0.5ml 离心管中并臵于-20 ℃保存（-80℃长期保存）
RIPA裂解液：可购买，也可自己配制配方：试剂浓度Tris碱50mmol/L,PH7.5氯化钠150mmol/LSDS0.1%EDTA1mmol/L1%NP-401%去氧胆酸钠(deoxycholate)RIPA裂解液（强）RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）1%TritonX-100,1%NP-40,1%NP-401%deoxycholate,0.5%deoxycholate0.25%deoxycholate0.1%SDS使用时还需要加入蛋白酶抑制剂等防止蛋白质降解
RIPA裂解液：可购买，也可自己配制 配方： 试剂 浓度 Tris碱 50mmol/L, PH7.5 氯化钠 150mmol/L SDS 0.1% EDTA 1mmol/L NP-40 1% 去氧胆酸钠(deoxycholate) 1% RIPA裂解液（强） RIPA裂解液（中） RIPA裂解液（弱） 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.5% deoxycholate 1% NP-40, 0.25% deoxycholate 使用时还需要加入蛋白酶抑制剂等防止蛋白质降解
对蛋白质进行定量BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型)一碧云天，货号为P0009产品名称包装产品编号P0009-1BCA试剂A500ml×2P0009-2BCA试剂B30ml30mg×2P0009-3蛋白标准（BSA）5mlP0009-4蛋白标准配制液
对蛋白质进行定量 BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)—碧云天 ,货号 为P0009 产品编号 产品名称 包装 P0009-1 BCA试剂 A 500ml×2 P0009-2 BCA试剂 B 30ml P0009-3 蛋白标准(BSA) 30mg×2 P0009-4 蛋白标准配制液 5ml
1.蛋白标准品的准备a.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20C长期保存。b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准，加入980ul稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCI或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃C长期保存。2.BCA工作液的配制根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100ulBCA试剂B，混匀，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定
1. 蛋白标准品的准备 a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制 成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。 b. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20µl 25mg/ml蛋白 标准，加入980µl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中， 标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释 标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20 ℃长期保存。 2. BCA工作液的配制 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作 液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100µl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定
3.蛋白浓度检测a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20ul，加标准品稀释液补足到20ul。请注意记录样品体积。C.各孔加入200ulBCA工作液，37℃C放置20-30分钟。注：也可以室温放置2小时，或60C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度，562nm最佳。e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度
3. 蛋白浓度检测 a. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准 品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5mg/ml。 b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20µl，加标准品稀释液补 足到20µl。请注意记录样品体积。 c. 各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放臵20-30分钟。 注: 也可以室温放臵2小时，或60ºC放臵30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会 随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低， 适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。 d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度，562nm最佳。 e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度
Western Blotting胶的制备结果分析上样显影25电泳孵育二抗T转膜封闭孵育一抗
Western Blotting 胶的制备 上样 电泳 封闭 孵育二抗 显影 转膜 孵育一抗 结果分析
胶的制备>清洗玻璃板、胶条；>检漏：用超纯水;>配制分离胶：用水或者异丙醇液封,大概需要30min~1h：>配制浓缩胶：15孔或者10孔梳子，梳子的厚度为10mm或者15mm,大概需要15~30min;垂直槽样品梳子（1.5mm，10孔）垂直槽样品栋子（1.5mm，15孔）垂直槽样品梳子（1.0mm，10孔）重直槽样品梳子（1.0mm，15孔）
胶的制备 清洗玻璃板、胶条； 检漏：用超纯水; 配制分离胶：用水或者异丙醇液封,大 概需要30min~1h; 配制浓缩胶：15孔或者10孔梳子，梳 子的厚度为10mm或者15mm,大概需要 15~30min;
所需各组分体积（单位：ml)分离胶分离胶浓凝胶体和4xTris-HCI-SDS分离胶缓30%Acr-Bis度(ml)蒸馏水TEMED10%APS(29:1)冲液，pH8.8根据目的蛋白的分子量大小1.02.71.25n选择合适的凝胶浓度，再按0.050.0042.5照下面的表格配制SDS102.00.15.40.008PAGE的分离胶（即下层胶：153.00.158.13.750.0126%不同浓度的SDS-PAGE分离4.0205.010.80.20.016胶的最佳分离范围306.00.316.27.50.024500.527.010.012.50.040SDS-PAGE分离胶浓度最住分离高出6%50-150KDn2.371.331.250.050.0038%胶30-90KD10%胶20-80kD2.72.5104.70.10.00612%股12-60kD15%胶10-40kD157.14.03.750.150.0098%5.0209.55.30.20.0123014.28.07.50.30.018如果配制非变性胶，参考分5023.713.312.50.50.030离胶配方，分离胶中不加2.031.671.250.050.00210%SDS即可配制成非变性PAGE胶。2.5104.073.330.10.004156.15.03.750.150.00610%5.06.7208.10.20.0083012.210.07.50.30.0125020.30.50.02016.712.5
分离胶 根据目的蛋白的分子量大小 选择合适的凝胶浓度，再按 照下面的表格配制SDSPAGE的分离胶(即下层胶)： 不同浓度的SDS-PAGE分离 胶的最佳分离范围 如果配制非变性胶，参考分 离胶配方，分离胶中不加 10%SDS即可配制成非变性 PAGE胶