第40卷第2期 南京医科大学学报(自然科学版) 2020年2月 Journal of Nanjing Medical University( Natural Sciences) 新型冠状病毒肺炎研究 冠状病毒疫苗研究进展及2019新型冠状病毒疫苗研发展望 张明顺·“,吉宁飞3 南京医科大学基础医学院免疫学系,国家卫生健康委员会抗体技术实重点验室,江苏南京211166;南京医科大学第一附 属医院呼吸与危重症医学科,江苏南京210029 [摘要]2019新型冠状病毒传染性强,危重症发生率高,亟需有效的防控手段。疫苗接种是保护易感者,阻断传染性疾病 传播的重要措施。文章总结了2002年SARS冠状病毒和2012年MERS冠状病毒疫苗灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗研究 进展。结合冠状病毒疫苗研究进展、牛痘苗的历史经验以及2019新型冠状病毒的特点,展望了2019新型冠状病毒疫苗研发的 可能途径 [关键词]2019新型冠状病毒;灭活疫苗;亚单位疫苗;DNA疫苗 [中图分类号]R563.1 [文献标志码]A [文章编号]1007-4368(2020)02-151-05 i:10.7655/ NYDXBNS20200201 Research and development of coronavirus vaccine and prospect of 2019 novel coronavirus vaccines ZHANG Mingshun., JI Ningfei Department of Immunology, Key Laboratory of Antibody Techniques, National Health Commission, Nanjing Medical University, Nanjing 211166: Department of Respiratory and Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanyjing 210029, China [Abstract] The emergence and outbreak of 2019 novel coronavirus(2019-nCov )have posed a great challenge. Vaccination is an effective way to protect the susceptible from the spread of infectious diseases. The purpose of this essay is to review the inactivated vaccine, subunit vaccine and DNA vaccine research progress of 2002 severe acute respiratory syndrome( SARS )coronavirus and 2012 middle east respiratory syndrome( MERS )coronavirus. Combined with the coronavirus vaccine progress, the history of vaccinia vaccine. and the characteristics of coronaviruses, we provide some potential approachesof vaccine development for 2019-nCol I Key words] 2019 novel coronavirus; inactivated vaccine; subunit vaccine; DNA vaccine [ J Nanjing Med Univ,2020,40(02):151-154,159] 2019年12月,新型冠状病毒(2019 novel corona-炎。世界卫生组织(WHO)将2019-nCoV引起的疾 vIrus,2019-nCoV)从武汉海鲜市场开始在人群中扩病称为2019冠状病毒病( coronavirus disease2019, 散,截止2020年2月19日24时,2019nCoV感染累 OVID-19);2019-nCoV可能不仅仅引起肺部损 计确诊74576例,死亡218例(信息来自国家卫生害,还可能引起消化道感染和其他脏器损伤。世 健康委员会官方网站)。中国国家卫生健康委员会界病毒分类委员会将2019-nCoV命名为严重急性呼 将2019-nCoV引起的疾病统称为新型冠状病毒肺吸综合征冠状病毒2型( severe acute respiratory syn drome coronavirus2,sARS-CoV-2)。国内外对于 [基金项目]国家自然科学基金面上项目(81671563) 将2019-nCoV命名为 SARS-CoV-2尚有一定争议,建 通信作者( Corresponding author),E-mil: mingshunzhang(anima.议修正为2019人类冠状病毒( human coronavirus 2019,HCoV-19)。本文用2019nCoV指代2019新
2019年12月，新型冠状病毒（2019 novel corona⁃ virus，2019⁃nCoV）从武汉海鲜市场开始在人群中扩 散［1］ ，截止2020年2月19日24时，2019⁃nCoV感染累 计确诊 74576 例，死亡 2118 例（信息来自国家卫生 健康委员会官方网站）。中国国家卫生健康委员会 将 2019⁃nCoV 引起的疾病统称为新型冠状病毒肺 炎。世界卫生组织（WHO）将 2019⁃nCoV 引起的疾 病称为 2019 冠状病毒病（coronavirus disease 2019， COVID⁃19）［2］ ；2019⁃nCoV 可能不仅仅引起肺部损 害，还可能引起消化道感染［3］ 和其他脏器损伤。世 界病毒分类委员会将2019⁃nCoV命名为严重急性呼 吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syn⁃ drome coronavirus 2，SARS⁃CoV⁃2）［4］ 。国内外对于 将2019⁃nCoV命名为SARS⁃CoV⁃2尚有一定争议，建 议修正为 2019 人类冠状病毒（human coronavirus 2019，HCoV⁃19）［5］ 。本文用2019⁃nCoV指代2019新 冠状病毒疫苗研究进展及2019新型冠状病毒疫苗研发展望 张明顺1，2* ，吉宁飞3 1 南京医科大学基础医学院免疫学系，2 国家卫生健康委员会抗体技术实重点验室，江苏 南京 211166；3 南京医科大学第一附 属医院呼吸与危重症医学科，江苏 南京 210029 ［摘 要］ 2019新型冠状病毒传染性强，危重症发生率高，亟需有效的防控手段。疫苗接种是保护易感者，阻断传染性疾病 传播的重要措施。文章总结了2002年SARS冠状病毒和2012年MERS冠状病毒疫苗灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗研究 进展。结合冠状病毒疫苗研究进展、牛痘苗的历史经验以及2019新型冠状病毒的特点，展望了2019新型冠状病毒疫苗研发的 可能途径。 ［关键词］ 2019新型冠状病毒；灭活疫苗；亚单位疫苗；DNA疫苗 ［中图分类号］ R563.14 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2020）02⁃151⁃05 doi：10.7655/NYDXBNS20200201 Research and development of coronavirus vaccine and prospect of 2019 novel coronavirus vaccines ZHANG Mingshun1，2* ，JI Ningfei3 1 Department of Immunology，2 Key Laboratory of Antibody Techniques，National Health Commission，Nanjing Medical University，Nanjing 211166；3 Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China ［Abstract］ The emergence and outbreak of 2019 novel coronavirus（2019⁃ nCoV）have posed a great challenge. Vaccination is an effective way to protect the susceptible from the spread of infectious diseases. The purpose of this essay is to review the inactivated vaccine，subunit vaccine and DNA vaccine research progress of 2002 severe acute respiratory syndrome（SARS）coronavirus and 2012 middle east respiratory syndrome（MERS）coronavirus. Combined with the coronavirus vaccine progress，the history of vaccinia vaccine， and the characteristics of coronaviruses，we provide some potential approachesof vaccine development for 2019⁃nCoV. ［Key words］ 2019 novel coronavirus；inactivated vaccine；subunit vaccine；DNA vaccine ［J Nanjing Med Univ，2020，40（02）：151⁃154，159］ ［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目（81671563） ∗ 通信作者（Corresponding author），E⁃mail：mingshunzhang@njmu. edu.cn 南京医科大学学报（自然科学版） Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） 第40卷第2期 2020年2月 ·新型冠状病毒肺炎研究· ·151·
第40卷第2期 南京医科大学学报 2020年2月 型冠状病毒。 肺脏出现超敏反应损伤,提示灭活疫苗可能不是有 冠状病毒是单正链RNA包膜病毒,广泛存在于效防控MERS的候选疫苗。2020年1月24日,浙江 自然界中。人类冠状病毒如229E、OC43、N63和省疾病控制中心分离得到2019-nCoV病毒株。病毒 HKUI等一般引起轻中度的呼吸道感染症状θ。株分离成功,给传统疫苗(灭活疫苗、减毒活疫苗) 2002年,严重急性呼吸综合征( severe acute respira-的制备带来了曙光 ry syndrome,SARS)冠状病毒(SARS-CoV)在国内 虽然目前2019-nCoV的免疫发病机制尚不明 爆发,wHO估计SARS确诊8098例,死亡774例,确,但我国有SARS灭活疫苗研发的丰富经验。在 病死率近10%。2012年,中东呼吸综合征(mde分离出2019-nCoV病毒株的基础上,我们应该尝试 east respiratory syndrome,MERS)冠状病毒(MERS-2019-nCoV灭活疫苗方案,包括:(1)分离更多的 ωV)在沙特等地爆发,wHO估计MEFS确诊18792019-nCoV病毒株进而选择合适的病毒株作为疫苗 例,死亡659例,病死率高达35%。不同于SARS株;(2)建立病毒的大规模培养及灭活方案;(3)免 和MERS症状典型,2019-nCoV感染后部分感染者疫佐剂的使用及小鼠等动物实验以验证安全性和 无症状,无症状感染者影响了对2019-nCoV病死率免疫原性。2019-ηCV灭活疫苗是否能够安全有效 的估算。在1099例病原学确诊病例中,死亡15例,的诱导免疫应答,尚需临床实验进行评价。 病死率14%m,低于SARS或者MERS 传染性疾病的防控三原则是控制传染源、阻断2亚单位疫苗 传播途径和保护易感者。疫苗是保护易感者、阻断 灭活疫苗成分复杂,含有病毒体的多种结构蛋 传染性疾病传播的有效手段,疫苗的发展和应用是白和非结构蛋白。亚单位疫苗组成简单,一般仅含 现代文明的重要特征。从疫苗的组成和工作原理有一种或者几种病毒蛋白,不需要病毒的培养与灭 区分,疫苗有多种类型:传统疫苗(灭活疫苗、减毒活,生物安全性相对更高。乙型肝炎病毒( hepatitis 活疫苗)、亚单位疫苗、重组载体疫苗、DNA疫苗以 B virus,HBV)亚单位疫苗通过重组病毒蛋白乙型肝 及RNA疫苗等。本文旨在回顾 SARS-CoV和MERS-炎病毒表面抗原( hepatitis B surface antigen, HBsAg) 传统疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗研究进展,可诱导中和抗体, HBsAg亚单位疫苗接种有效阻断了 并以此展望2019-nCoV疫苗研究。 HBⅤ在中国的传播,证明了亚单位疫苗的免疫效果 冠状病毒重要结构蛋白剌突蛋白( spike,S),与 1灭活疫苗 病毒进入易感细胞密切相关,其近N端的S功能结 2002年11月,SARS爆发;2003年4月,分离得构域含有受体结合区( receptor binding domain 到SARS-CoV病毒株。2004年9月,暨南大学报RBD),与细胞表面的血管紧缩素转化酶2( angioten 道,福尔马林灭活疫苗接种Babe小鼠,诱导出高滴 sin-converting enzyme2,ACE2)结合,通过近C端的 度SARS-CσⅤ抗体ω。2005年5月,中国科学院武S功能结构域与细胞膜融合,介导病毒进入细胞。 汉病毒所报道,应用福尔马林灭活的SARS-CoV疫与SARS-CoV比较,2019-nCoV的S蛋白尤其是 苗接种猕猴,可以安全有效地诱导出中和抗体。但RBD有4个氨基酸突变,但S蛋白仍可与ACE2有 遗憾的是,SARS-CoV猕猴感染模型症状不典型,实效结合。体外细胞实验证明,ACE2是2019-nCoV 验没有能够回答灭活疫苗是否有保护效果。的识别受体明。冷冻电镜观察发现,2019-nCoV的S 2007年2月,北京中日友好医院报道,β-丙醇酸内酯蛋白胞外区结构与SARS-CoV高度相似,但2019 灭活的SARS-CoⅤV疫苗接种健康受试者后,可诱导nCoV的S蛋白与ACE2的结合力更高,这可能是 有效的免疫应答。雪貂是流感病毒研究的模式2019-nCoV高传染性的原因之一。遗憾的是,SARS- 动物,感染SARS-CoV后,雪貂出现发热、流鼻涕和CoV的中和抗体S230等不能有效结合2019-nCoV的 喷嚏等SARS典型症状。在雪貂感染冠状病毒模型S蛋白,提示解析2019-nCoV的S蛋白中和表位、研 中,福尔马林灭活疫苗可以诱导出SARS-CoV抗体,发S蛋白亚单位疫苗的必要性 疫苗接种动物的排毒时间缩短1周。与SARS SARS-CoV主要有S蛋白、膜蛋白( membrane CoⅤ疫苗研究历程类似,2012年MERS爆发,2016年M)、核衣壳蛋白( nuclear,N)和以及3a蛋白等结构 MERS-CoV灭活疫苗接种小鼠,虽然灭活疫苗成蛋白。M蛋白和3a蛋白也可以诱导中和抗体,N 功诱导出中和抗体,但是灭活疫苗接种后的小鼠,蛋白可以通过交叉提呈诱导CD8T细胞活化。需要
南 京 医 科 大 学 学 报 第40卷第2期 2020年2月 型冠状病毒。 冠状病毒是单正链RNA包膜病毒，广泛存在于 自然界中。人类冠状病毒如 229E、OC43、NL63 和 HKU1 等一般引起轻中度的呼吸道感染症状［6］。 2002 年，严重急性呼吸综合征（severe acute respira⁃ tory syndrome，SARS）冠状病毒（SARS⁃CoV）在国内 爆发［7］ ，WHO 估计 SARS 确诊 8098 例，死亡 774 例， 病死率近10%［8］ 。2012年，中东呼吸综合征（middle east respiratory syndrome，MERS）冠状病毒（MERS ⁃ CoV）在沙特等地爆发［9］ ，WHO估计MERS确诊1879 例，死亡 659 例，病死率高达 35%［10］ 。不同于 SARS 和 MERS 症状典型，2019⁃nCoV 感染后部分感染者 无症状，无症状感染者影响了对2019⁃nCoV病死率 的估算。在1099例病原学确诊病例中，死亡15例， 病死率1.4%［11］ ，低于SARS或者MERS。 传染性疾病的防控三原则是控制传染源、阻断 传播途径和保护易感者。疫苗是保护易感者、阻断 传染性疾病传播的有效手段，疫苗的发展和应用是 现代文明的重要特征。从疫苗的组成和工作原理 区分，疫苗有多种类型：传统疫苗（灭活疫苗、减毒 活疫苗）、亚单位疫苗、重组载体疫苗、DNA 疫苗以 及RNA疫苗等。本文旨在回顾SARS⁃CoV和MERS⁃ CoV 传统疫苗、亚单位疫苗和 DNA 疫苗研究进展， 并以此展望2019⁃nCoV疫苗研究。 1 灭活疫苗 2002 年 11 月，SARS 爆发；2003 年 4 月，分离得 到 SARS⁃CoV 病毒株［12］ 。2004 年 9 月，暨南大学报 道，福尔马林灭活疫苗接种Balb/c小鼠，诱导出高滴 度 SARS⁃CoV 抗体［13］ 。2005 年 5 月，中国科学院武 汉病毒所报道，应用福尔马林灭活的 SARS⁃CoV 疫 苗接种猕猴，可以安全有效地诱导出中和抗体。但 遗憾的是，SARS⁃CoV猕猴感染模型症状不典型，实 验没有能够回答灭活疫苗是否有保护效果［14］。 2007年2月，北京中日友好医院报道，β⁃丙醇酸内酯 灭活的 SARS⁃CoV 疫苗接种健康受试者后，可诱导 有效的免疫应答［15］ 。雪貂是流感病毒研究的模式 动物，感染SARS⁃CoV 后，雪貂出现发热、流鼻涕和 喷嚏等SARS典型症状。在雪貂感染冠状病毒模型 中，福尔马林灭活疫苗可以诱导出SARS⁃CoV抗体， 疫苗接种动物的排毒时间缩短 1 周［16］ 。与 SARS⁃ CoV疫苗研究历程类似，2012年MERS爆发，2016年 MERS⁃CoV 灭活疫苗接种小鼠［17］ ，虽然灭活疫苗成 功诱导出中和抗体，但是灭活疫苗接种后的小鼠， 肺脏出现超敏反应损伤，提示灭活疫苗可能不是有 效防控MERS的候选疫苗。2020年1月24日，浙江 省疾病控制中心分离得到2019⁃nCoV病毒株。病毒 株分离成功，给传统疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗） 的制备带来了曙光。 虽然目前 2019⁃nCoV 的免疫发病机制尚不明 确，但我国有 SARS 灭活疫苗研发的丰富经验。在 分离出2019⁃nCoV病毒株的基础上，我们应该尝试 2019⁃nCoV 灭活疫苗方案，包括：（1）分离更多的 2019⁃nCoV病毒株进而选择合适的病毒株作为疫苗 株；（2）建立病毒的大规模培养及灭活方案；（3）免 疫佐剂的使用及小鼠等动物实验以验证安全性和 免疫原性。2019⁃nCoV灭活疫苗是否能够安全有效 的诱导免疫应答，尚需临床实验进行评价。 2 亚单位疫苗 灭活疫苗成分复杂，含有病毒体的多种结构蛋 白和非结构蛋白。亚单位疫苗组成简单，一般仅含 有一种或者几种病毒蛋白，不需要病毒的培养与灭 活，生物安全性相对更高。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）亚单位疫苗通过重组病毒蛋白乙型肝 炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg） 可诱导中和抗体，HBsAg亚单位疫苗接种有效阻断了 HBV在中国的传播，证明了亚单位疫苗的免疫效果。 冠状病毒重要结构蛋白刺突蛋白（spike，S），与 病毒进入易感细胞密切相关，其近N端的S1功能结 构 域 含 有 受 体 结 合 区（receptor binding domain， RBD），与细胞表面的血管紧缩素转化酶2（angioten⁃ sin⁃converting enzyme 2，ACE2）结合，通过近 C 端的 S2功能结构域与细胞膜融合，介导病毒进入细胞。 与 SARS ⁃ CoV 比较，2019 ⁃ nCoV 的 S 蛋白尤其是 RBD 有 4 个氨基酸突变，但 S 蛋白仍可与 ACE2 有 效结合［18］ 。体外细胞实验证明，ACE2是2019⁃nCoV 的识别受体［19］ 。冷冻电镜观察发现，2019⁃nCoV的S 蛋白胞外区结构与SARS⁃CoV高度相似［20］ ，但2019⁃ nCoV 的 S 蛋白与 ACE2 的结合力更高，这可能是 2019⁃nCoV高传染性的原因之一。遗憾的是，SARS⁃ CoV的中和抗体S230等不能有效结合2019⁃nCoV的 S蛋白，提示解析2019⁃nCoV的S蛋白中和表位、研 发S蛋白亚单位疫苗的必要性。 SARS⁃CoV 主要有 S 蛋白、膜蛋白（membrane， M）、核衣壳蛋白（nuclear，N）和以及 3a 蛋白等结构 蛋白［21］ 。M蛋白和3a蛋白也可以诱导中和抗体，N 蛋白可以通过交叉提呈诱导CD8+ T细胞活化。需要 ·152·
第40卷第2期 张明顺,吉宁飞冠状病毒疫苗研究进展及2019新型冠状病毒疫苗研发展望[J]」 2020年2月 南京医科大学学报(自然科学版),2020,40(2):151-154,159 153 注意的是,病毒蛋白具有多种生物学功能,如3a蛋高度一致。随着感染在人群中的不断扩散和可能 白可以下调Ⅰ型IN通路降低抗病毒免疫凹,活化发生的病毒免疫逃逸,2019-nCoV是否会发生突变 炎症小体增强炎症性损伤。根据基因组测序信息,进而改变靶抗原的免疫原性?参考HIV-IDNA疫 2019-nCoV可能包括S蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白苗研究经验,可以考虑在2019- nOv dna疫苗中 以及1ab/3/7/8/9/0b/13/4等12种结构蛋白。针包括多个冠状病毒株的S蛋白编码序列从而更好地 对这些结构蛋白功能与免疫原性进一步分析,将有诱导广谱中和抗体。 助于2019-nCoV亚单位疫苗的研发。 4对2019新型冠状病毒疫苗研发的思考与展望 3DNA疫苗 41安全性和有效性 相较于亚单位疫苗,DNA疫苗在体内表达病毒 对疫苗接种安全性的担忧,首先来自于疫苗本 蛋白抗原,模拟了病毒蛋白在宿主细胞内的表达,身。灭活疫苗,接种剂量大,可能会引起发热等;减 可以更好地保持病毒蛋白的天然构象表位。DNA毒活疫苗,在接种体内复制,可能在免疫功能异常 疫苗在宿主细胞中表达病毒蛋白,可以诱导相对平个体引起严重后果。在Ⅰ期临床实验中,健康志愿 衡的细胞免疫应答和体液免疫应答。传统疫苗需者可以耐受 SARS-CoV灭活疫苗,提示冠状病毒 要培养完整的病毒颗粒,亚单位疫苗则需要表达和灭活疫苗是安全的。2019-nCoV与SARS-CoV亲缘 纯化目的蛋白,而DNA疫苗只需要制备含有抗原基关系近,即便如此,在获得2019-nCoV灭活疫苗安全 因序列的表达质粒,制备工艺简单。早于SARS-有效的直接证据之前必须时刻谨慎。亚单位疫苗 CoⅤ灭活疫苗(2004年9月),2004年4月已有研是在体外表达、纯化的病毒蛋白,不利于保持蛋白 究报道,编码 SARS-COVS蛋白的DNA疫苗在小鼠体的构象表位;且亚单位疫苗一般免疫原性比较弱。 内可诱导细胞免疫应答和中和抗体。更重要的对于DNA疫苗安全性最大的担忧,来自于其可能随 是,在SARS-CoV攻毒实验中,接种DNA疫苗小鼠体机整合到宿主基因组上。近30年的DNA疫苗研究 内的SARS-CoⅤ基本被完全清除,显示DNA疫苗具已经充分证明了DNA疫苗人群接种的安全性。 有强大的保护效果。2008年11月, SARS-COVS蛋白DNA疫苗在人体内的免疫效果比较弱,采用DNA疫 DNA疫苗在I期临床实验中诱导岀保护性细胞免疫苗初次免疫、蛋白质疫苗加强免疫等免疫策略,可 应答和中和抗体。 SARS-COV的结构蛋白,如N蛋以有效增强DNA疫苗的免疫效果。DNA疫苗与 白和M蛋白等,在DNA疫苗研究中也有报道。有亚单位疫苗的联合应用,或许是2019-nCoV疫苗的 趣的是,M蛋白能比S蛋白更有效地诱导中和抗体研究方向之 和细胞免疫应答。MERS-CoVS蛋白DNA疫苗是首 2019-nCoV患者的血清中含有能阻断病毒感染 个进入Ⅰ期临床的MERS疫苗,研究结果显示其在的中和抗体;康复期患者血浆能够快速降低2019 小鼠、骆驼和猕猴中具有较好的免疫原性,并在肺-nCoV患者病毒载量,有效缓解临床症状。但是,疫 部感染模型中能够保护猕猴不受MERS病毒感染的苗接种后引起的免疫应答也是双刃剑,抗体既可能 影响。Ⅰ期临床实验结果显示,大部分受试者能结合病毒受体阻断病毒传播,也可能结合Fc受体促 够检测到疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫反应,不进病毒感染,如SARS-CωV的S蛋白单克隆抗体可促 良反应轻微且自限。 进巨噬细胞感染圜;猫传染性腹膜炎病毒( feline in- 制备2019 nOv dNA疫苗需有两个重要前提; fectious peritonitis virus,FPV,猫冠状病毒)S蛋白的 第一是基因组信息,尤其是病毒蛋白基因编码序单克隆抗体可能促进病毒巨噬细胞感染∽;MERS- 列;第二是病毒的生物学特征和疾病的发病机制。CoⅤ灭活疫苗诱导超敏反应而加重肺部损害。随 2019-nCoV病毒的生物学特征和疾病发病机制的阐着对2019-nCoV致病机制的进一步了解,将有助于 明,有助于指导选择病毒蛋白作为适合的DNA疫苗选择更安全有效的疫苗株和靶抗原。 抗原。随着209-nCoⅤ的生物学特征和疾病发病机42牛痘苗是否有助于2019新型冠状病毒疫苗的 制研究的深入,同时参考SARS-CoV和MERS-CoV研究 疫苗的研究经验,我们可以优先选择S蛋白和(或) 历史上最成功的疫苗是牛痘苗,消除了人间天 M蛋白、N蛋白等制备单价或者多价DNA疫苗。目花病毒的传播。牛痘苗的本质是感染牛的天花病 前分离得到的2019-nCo不同病毒株的基因组序列毒,具有种属特异性。牛痘苗诱导交叉性保护免疫
注意的是，病毒蛋白具有多种生物学功能，如3a蛋 白可以下调Ⅰ型IFN通路降低抗病毒免疫［22］ ，活化 炎症小体增强炎症性损伤。根据基因组测序信息， 2019⁃nCoV可能包括S蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白 以及 1ab/3/7/8/9/10b/13/14 等 12 种结构蛋白［23］ 。针 对这些结构蛋白功能与免疫原性进一步分析，将有 助于2019⁃nCoV亚单位疫苗的研发。 3 DNA疫苗 相较于亚单位疫苗，DNA疫苗在体内表达病毒 蛋白抗原，模拟了病毒蛋白在宿主细胞内的表达， 可以更好地保持病毒蛋白的天然构象表位。DNA 疫苗在宿主细胞中表达病毒蛋白，可以诱导相对平 衡的细胞免疫应答和体液免疫应答。传统疫苗需 要培养完整的病毒颗粒，亚单位疫苗则需要表达和 纯化目的蛋白，而DNA疫苗只需要制备含有抗原基 因序列的表达质粒，制备工艺简单。早于 SARS ⁃ CoV 灭活疫苗（2004 年 9 月）［13］ ，2004 年 4 月已有研 究报道，编码SARS⁃CoVS蛋白的DNA疫苗在小鼠体 内可诱导细胞免疫应答和中和抗体［24］ 。更重要的 是，在SARS⁃CoV攻毒实验中，接种DNA疫苗小鼠体 内的SARS⁃CoV基本被完全清除，显示DNA疫苗具 有强大的保护效果。2008年11月，SARS⁃CoVS蛋白 DNA疫苗在I期临床实验中诱导出保护性细胞免疫 应答和中和抗体［25］ 。SARS⁃CoV的结构蛋白，如N蛋 白和M蛋白等，在DNA疫苗研究中也有报道［8］ 。有 趣的是，M蛋白能比S蛋白更有效地诱导中和抗体 和细胞免疫应答。MERS⁃CoVS蛋白DNA疫苗是首 个进入Ⅰ期临床的MERS疫苗，研究结果显示其在 小鼠、骆驼和猕猴中具有较好的免疫原性，并在肺 部感染模型中能够保护猕猴不受MERS病毒感染的 影响［26］ 。Ⅰ期临床实验结果显示，大部分受试者能 够检测到疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫反应，不 良反应轻微且自限［27］ 。 制备2019⁃nCoV DNA疫苗需有两个重要前提； 第一是基因组信息，尤其是病毒蛋白基因编码序 列；第二是病毒的生物学特征和疾病的发病机制。 2019⁃nCoV病毒的生物学特征和疾病发病机制的阐 明，有助于指导选择病毒蛋白作为适合的DNA疫苗 抗原。随着209⁃nCoV的生物学特征和疾病发病机 制研究的深入，同时参考 SARS⁃CoV 和 MERS⁃CoV 疫苗的研究经验，我们可以优先选择S蛋白和（或） M蛋白、N蛋白等制备单价或者多价DNA疫苗。目 前分离得到的2019⁃nCoV不同病毒株的基因组序列 高度一致。随着感染在人群中的不断扩散和可能 发生的病毒免疫逃逸，2019⁃nCoV 是否会发生突变 进而改变靶抗原的免疫原性？参考 HIV⁃1 DNA 疫 苗研究经验［28］ ，可以考虑在2019⁃nCoV DNA疫苗中 包括多个冠状病毒株的S蛋白编码序列从而更好地 诱导广谱中和抗体。 4 对2019新型冠状病毒疫苗研发的思考与展望 4.1 安全性和有效性 对疫苗接种安全性的担忧，首先来自于疫苗本 身。灭活疫苗，接种剂量大，可能会引起发热等；减 毒活疫苗，在接种体内复制，可能在免疫功能异常 个体引起严重后果。在Ⅰ期临床实验中，健康志愿 者可以耐受 SARS⁃CoV 灭活疫苗［15］ ，提示冠状病毒 灭活疫苗是安全的。2019⁃nCoV与SARS⁃CoV 亲缘 关系近，即便如此，在获得2019⁃nCoV灭活疫苗安全 有效的直接证据之前必须时刻谨慎。亚单位疫苗 是在体外表达、纯化的病毒蛋白，不利于保持蛋白 的构象表位；且亚单位疫苗一般免疫原性比较弱。 对于DNA疫苗安全性最大的担忧，来自于其可能随 机整合到宿主基因组上。近30年的DNA疫苗研究 已经充分证明了 DNA 疫苗人群接种的安全性。 DNA疫苗在人体内的免疫效果比较弱，采用DNA疫 苗初次免疫、蛋白质疫苗加强免疫等免疫策略，可 以有效增强DNA疫苗的免疫效果［28］ 。DNA疫苗与 亚单位疫苗的联合应用，或许是2019⁃nCoV疫苗的 研究方向之一。 2019⁃nCoV患者的血清中含有能阻断病毒感染 的中和抗体［19］ ；康复期患者血浆能够快速降低2019 ⁃nCoV患者病毒载量，有效缓解临床症状。但是，疫 苗接种后引起的免疫应答也是双刃剑，抗体既可能 结合病毒受体阻断病毒传播，也可能结合Fc受体促 进病毒感染，如SARS⁃CoV的S蛋白单克隆抗体可促 进巨噬细胞感染［29］ ；猫传染性腹膜炎病毒（feline in⁃ fectious peritonitis virus，FIPV，猫冠状病毒）S蛋白的 单克隆抗体可能促进病毒巨噬细胞感染［30］ ；MERS⁃ CoV灭活疫苗诱导超敏反应而加重肺部损害［17］ 。随 着对2019⁃nCoV致病机制的进一步了解，将有助于 选择更安全有效的疫苗株和靶抗原。 4.2 牛痘苗是否有助于2019新型冠状病毒疫苗的 研究 历史上最成功的疫苗是牛痘苗，消除了人间天 花病毒的传播。牛痘苗的本质是感染牛的天花病 毒，具有种属特异性。牛痘苗诱导交叉性保护免疫 第40卷第2期 2020年2月 张明顺，吉宁飞. 冠状病毒疫苗研究进展及2019新型冠状病毒疫苗研发展望［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2020，40（2）：151-154，159 ·153·
第40卷第2期 南京医科大学学报 2020年2月 应答,受试者获得抵抗天花病毒感染的免疫保护[5] JIANGSB,SHZL, SHUYI,tal. a distinct name is need- 力。在动物中,也有各种冠状病毒,如FIPV、血凝 ed for the new coronavirus [J]. Lancet, 2020, do 性脑脊髓炎病毒( hemagglutinating encephalomyelitis 10.1016/501406736(20)30419-0 virus,HEV,猪冠状病毒)、传染性支气管炎病毒(in[6】 FIELDINGBO. Human coronavirus NI63: a clinically im fectious bronchitis virus,IBV,禽冠状病毒)以及小鼠 portant virus? [J]. Future Microbiol, 2011, 6(2):153-159 肝炎病毒( mouse hepatitis virus,MHV,鼠冠状病 [7] PEIRISJS, GUANY, YUENKY. Severe acute respiratory yndrome[J]. Nat Med, 2004, 10(12 Suppl): S88-S97 毒)。这些动物冠状病毒也有种属特异性。人类与[8] ROPERRI, REHMKE. SARS vaccines: where are we?j 猫/猪等共存了千年, FIPV/HEV等的安全性是否与 Expert Rev Vaccines, 2009, 8(7): 887-898 牛痘苗相当?更关键的是, FIPV/HEV是否可能会[9] ZAKIAM, VAN BOHEEMENS, BESTEBROERTM,etal. 诱导交叉性保护应答?目前动物冠状病毒减毒疫苗 Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumo 已经在畜牧业中得到了有效应用,这些冠状病毒减 nia in Saudi Arabia[J]. N Engl J Med, 2012. 367(19) 毒疫苗是否有助于对阻断2019-mCoV传播?这些问 题值得进一步探讨。 [10] ARABIYM, BALKHYHH, HAYDENFG, et al.Middle 4.32019nCoV疫苗何时问世 east respiratory syndrome [J].N Engl J Med,2017,376 (6):584-594 虽然2019nCoV尚未构成世界疫情大流行,但[1] GUANW,Nz,HUy,a. Clinical ch 是其传播性已经远远超过了SARS-CoV。2004年之 2019 novel coronavirus infection in China [J.MedRxiv 后,SARS仅有新加坡的实验室感染报道。SARS 2020,doi:10.1101/2020.020620020974 “消失”了,完成了I期临床实验的SARS-CoV灭活[12] KSIAZEKTG, ERDMAND, GOLDSMITHCS,eta.Anoy 疫苗因此也失去了历史使命。鉴于2019-nCoV与 virus associated with severe acute respiratory SARS-CoV的亲缘关系,尘封已久的 SARS-CoV灭活 syndrome[J]. N Engl J Med, 2003, 348(20): 1953-1966 疫苗是否可以诱导出针对2019mCV的交叉免疫保[13 XIONGS, WANGY, HANGM, et al. Immunogenicity of 护还有待进一步研究。如果直接使用SARS-CoV灭 SARS inactivated vaccine in BALB/e mice [].Immunol 活疫苗来预防2019-nCoV,那么疫苗的研制和临床 lett,2004,95(2):139-143 [14] ZHOUJ, WANGW, ZHONGQ, et al. Immunogenicity, safe 应用将是最快捷的。否则,从SARS和MERS疫苗的 ty, and protective efficacy of an inactivated SARS-associ- 研究历史来看,2019-nCoV疫苗必须历经动物实验 ated coronavirus vaccine in rhesus monkeys[J].Vaccine 和临床实验,不可能一蹴而就。从2002年SARS爆 2005,23(24):3202-3209 发近20年来,中国的科研能力已得到长足发展,相15]LN, ZHANGJ,SUN,etal. Safety and immunogenicity 信并期待科研工作者能早日成功研制出2019nCoV from a phase I trial of inactivated severe acute respiratory 疫苗,为我们战胜2019-nCoV传播提供战略性武器。 syndrome coronavirus vaccine [J]. Antivir Ther, 2007, 12 (7):1107-1113 [参考文献] [16] DARNELLME, PLANTEP, WATANABEH, et al.Severe [1 ZHUN, ZHANGD, WANGW, et al. A novel coronavirus acute respiratory syndrome coronavirus infection in vacci- from patients with pneumonia in China, 2019[J].N Engl nated ferrets [J. J Infect Dis, 2007, 196(9): 1329-1338 JMed,2020,382(8):727-733 [17 AGRAWALAS, TAOX, ALGAISSIA, et al. Immunization [2] SMITHN, FRASERM Straining the system: novel corona- with inactivated middle east respiratory syndrome corona- irus(covid-19) and preparedness for concomitant disas- virus vaccine leads to lung immunopathology on challenge ters [J]. Am J Public Health,2020:el-e2, doi: 10.2105/ with live virus [J]. Hum Vaccin Immunother, 2016,12 AJPH.2020.305618 (9):2351-2356 [3] ZHANGH, KANGZj, GONGHY, et al. The digestive sys- [18] WANY, SHANGJ, GRAHAMR, et al. Receptor recogni tem is a potential route of 2019-nCow infection: a bioinfor tion by novel coronavirus from wuhan An analysis based matics analysis based on single-cell transcriptomes. [J] decade-long structural studies of SARS [].J Virol BioRxiy,2020,doi:10.ll01/2020.01.30.927806 2020,doi:10.1128/VL.00127-20 [4] GORBALENYAAE, BAKERSC,, BARICR S et al. Severe [19] ZHOUP, YANGX, WANGX, et al. A pneumonia outbreak acute respiratory syndrome-related coronavirus: The spe- associated with a new coronavirus of probable bat origi cies and its viruses -a statement of the Coronavirus Study [J]. Nature,2020,doi:10.103841586-00-2012-7 Group[门 BioRxiv,2020,doi:10.01/2020.02.07.937862 (下转第159页)
南 京 医 科 大 学 学 报 第40卷第2期 2020年2月 应答，受试者获得抵抗天花病毒感染的免疫保护 力。在动物中，也有各种冠状病毒［31］ ，如FIPV、血凝 性脑脊髓炎病毒（hemagglutinating encephalomyelitis virus，HEV，猪冠状病毒）、传染性支气管炎病毒（in⁃ fectious bronchitis virus，IBV，禽冠状病毒）以及小鼠 肝 炎 病 毒（mouse hepatitis virus，MHV，鼠 冠 状 病 毒）。这些动物冠状病毒也有种属特异性。人类与 猫/猪等共存了千年，FIPV/HEV 等的安全性是否与 牛痘苗相当？更关键的是，FIPV/HEV 是否可能会 诱导交叉性保护应答?目前动物冠状病毒减毒疫苗 已经在畜牧业中得到了有效应用，这些冠状病毒减 毒疫苗是否有助于对阻断2019⁃nCoV传播？这些问 题值得进一步探讨。 4.3 2019⁃nCoV疫苗何时问世 虽然2019⁃nCoV尚未构成世界疫情大流行，但 是其传播性已经远远超过了SARS⁃CoV。2004年之 后，SARS仅有新加坡的实验室感染报道［32］ 。SARS “消失”了，完成了Ⅰ期临床实验的SARS⁃CoV 灭活 疫苗因此也失去了历史使命。鉴于 2019⁃nCoV 与 SARS⁃CoV的亲缘关系，尘封已久的SARS⁃CoV灭活 疫苗是否可以诱导出针对2019⁃nCoV的交叉免疫保 护还有待进一步研究。如果直接使用SARS⁃CoV灭 活疫苗来预防 2019⁃nCoV，那么疫苗的研制和临床 应用将是最快捷的。否则，从SARS和MERS疫苗的 研究历史来看，2019⁃nCoV 疫苗必须历经动物实验 和临床实验，不可能一蹴而就。从2002年SARS爆 发近20年来，中国的科研能力已得到长足发展，相 信并期待科研工作者能早日成功研制出2019⁃nCoV 疫苗，为我们战胜2019⁃nCoV传播提供战略性武器。 ［参考文献］ ［1］ ZHUN，ZHANGD，WANGW，et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China，2019［J］. N Engl J Med，2020，382（8）：727-733 ［2］ SMITHN，FRASERM. Straining the system：novel corona⁃ virus（covid ⁃19）and preparedness for concomitant disas⁃ ters［J］. Am J Public Health，2020：e1⁃e2，doi：10.2105/ AJPH.2020.305618 ［3］ ZHANGH，KANGZj，GONGHY，et al. The digestive sys⁃ tem is a potential route of 2019⁃nCov infection：a bioinfor⁃ matics analysis based on single ⁃ cell transcriptomes.［J］. BioRxiv，2020，doi：10.1101/2020.01.30.927806 ［4］ GORBALENYAAE，BAKERSC，BARICR S，et al. Severe acute respiratory syndrome ⁃ related coronavirus：The spe⁃ cies and its viruses ⁃a statement of the Coronavirus Study Group［J］. BioRxiv，2020，doi：10.1101/2020.02.07.937862 ［5］ JIANGSB，SHIZL，SHUYL，et al. A distinct name is need⁃ ed for the new coronavirus［J］. Lancet，2020，doi： 10.1016/S0140⁃6736（20）30419-0 ［6］ FIELDINGBC. Human coronavirus NL63：a clinically im⁃ portant virus?［J］. Future Microbiol，2011，6（2）：153-159 ［7］ PEIRISJS，GUANY，YUENKY. Severe acute respiratory syndrome［J］. Nat Med，2004，10（12 Suppl）：S88-S97 ［8］ ROPERRL，REHMKE. SARS vaccines：where are we?［J］. Expert Rev Vaccines，2009，8（7）：887-898 ［9］ ZAKIAM，VAN BOHEEMENS，BESTEBROERTM，et al. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumo⁃ nia in Saudi Arabia［J］. N Engl J Med，2012，367（19）： 1814-1820 ［10］ ARABIYM，BALKHYHH，HAYDENFG，et al. Middle east respiratory syndrome［J］. N Engl J Med，2017，376 （6）：584-594 ［11］ GUANW，NIZ，HUY，et al. Clinical characteristics of 2019 novel coronavirus infection in China［J］. MedRxiv， 2020，doi：10.1101/2020.02.06.20020974 ［12］KSIAZEKTG，ERDMAND，GOLDSMITHCS，et al. A nov⁃ el coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome［J］. N Engl J Med，2003，348（20）：1953-1966 ［13］XIONGS，WANGY，ZHANGM，et al. Immunogenicity of SARS inactivated vaccine in BALB/c mice［J］. Immunol Lett，2004，95（2）：139-143 ［14］ ZHOUJ，WANGW，ZHONGQ，et al. Immunogenicity，safe⁃ ty，and protective efficacy of an inactivated SARS⁃associ⁃ ated coronavirus vaccine in rhesus monkeys［J］. Vaccine， 2005，23（24）：3202-3209 ［15］LINJ，ZHANGJ，SUN，et al. Safety and immunogenicity from a phase I trial of inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine［J］. Antivir Ther，2007，12 （7）：1107-1113 ［16］DARNELLME，PLANTEP，WATANABEH，et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection in vacci⁃ nated ferrets［J］. J Infect Dis，2007，196（9）：1329-1338 ［17］AGRAWALAS，TAOX，ALGAISSIA，et al. Immunization with inactivated middle east respiratory syndrome corona⁃ virus vaccine leads to lung immunopathology on challenge with live virus［J］. Hum Vaccin Immunother，2016，12 （9）：2351-2356 ［18］ WANY，SHANGJ，GRAHAMR，et al. Receptor recogni⁃ tion by novel coronavirus from Wuhan：An analysis based on decade ⁃ long structural studies of SARS［J］. J Virol， 2020，doi：10.1128/JVI.00127-20 ［19］ ZHOUP，YANGX，WANGX，et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin ［J］. Nature，2020，doi：10.1038/s41586⁃020⁃2012-7 （下转第159页） ·154·
第40卷第2期 张茜冯振卿.新型冠状病毒肺炎的抗体应对策略[J] 2020年2月 南京医科大学学报(自然科学版),2020,40(2):155-159 159 mation[j].biorxiV,2020,doi:https://doi.org/10.1101/ has broad neutralizing potency against H5N1 influenza A 2020.02.11944462 viruses of different clades [j]. Antiviral Res, 2013, 90 [22] ZHOU P, YANG X, WANG X, et al. Discovery of a novel oronavirus associated with the recent pneumonia out- [24] ZHANG X, ZHANG C, LIU Y, et al. Construction of scFv and its potential bat origin [J][J]. hage display library with hapten-specific repertories and BbioRxiv,2020,doi:https://doi.org/10.1101/2020.01.22. characterizationof anti-ivermectin fragment isolated from 914952 the library [J]. Eur Food Res Technol, 2010, 231(3) [23]ZHANG X, QI X, ZHANG Q, et al. Human 4F5 423-430 chain Fy antibody recognizing a conserved HAl 收稿日期]2020-02-18 (上接第154页) ry syndrome coronavirus in nonhuman primates [J].Sc [20]WRAPPD, WANGN, CORBETTK S, et al. Cryo-EM struc- Transl med,2015,7(301):301ral32 ture of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation [27] MODjARRADK, ROBERTSCC, MILISKT, et al. Safety []. Science, 2020, doi: 10.1126/science. abb2507 and immunogenicity of an anti- Middle East respiratory [21] ENJUANESL, DEDIEGOML, ALVAREZE, et al. V syndrome coronavirus DNA vaccine: a phase 1, open-la to prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus- bel, single-arm, dose-escalation trial [J]. Lancet Infect induced disease[J]. Virus Res, 2008, 133(1): 45-62 Dis,2019,19(9):1013-1022 [22]MINAKSHIR, PADHANK RANIM, et al. The SARS coro- [28] FYNANEF, LUS, ROBINSONHL, et al. One group's his- navirus 3a protein causes endoplasmic reticulum stress torical reflections on dna vaccine development [J].Hum and induces ligand-independent downregulation of the Gene ther,2018,29(9):966-970 type I interferon receptor [J]. PLoS One, 2009, 4(12): [29] YIPMS, LEUNGNH, CHEUNGCY,et al. Antibody-depen- [23 LUR, ZHAO X, LI, et al. Genomic characterisation and spiratory syndrome coronavirus[J]. Virol J, 2014, 11(1) epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. [J]. Lancet, 2020, doi: [30] OLSEN CW, NGICHABE CK BAINES JD, et al. Mono- 10.1016/50140-6736(20)30251-8 clonal antibodies to the spike protein of feline infectious 124 YANGZY, KONGWP, HUANGY, et al. A DNA vaccine peritonitis virus mediate antibody -dependent enhance- induces SARS coronavirus neutralization and protective ment of infection of feline macrophages [J].JVirol, 1992 immunity in mice[J]. Nature, 2004, 428(6982): 561-564 66(2):956-965 [25] MARTINJE, LOUDERMK, HOLMAN LA, et al. A SARS [31] HOLMESKV. SARS coronavirus: a new challenge for pre- DNA vaccine induces neutralizing antibody and cellula vention and therapy [J].J Clin Invest, 2003. 111(11) immune responses in healthy adults in a phase I clinical 1605-1609 tna[J. Vaccine,2008,26(50):6338-6343 [32 LimPL, KURUPA, GOPALAKRISHNAG, et al.Laboral [26 MUTHUMANIK, FALZARANOD, REUSCHELEL, et al acquired severe acute respiratory syndrome [J]. N Engl J A synthetic consensus anti-spike protein DNA vaccine in- Med,2004,350(17):1740-1745 uces protective immunity against Middle East respirato- [收稿日期]200-02-20
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