《生命奥秘》：荧光蛋白技术的最新研究进展.pdf_大学文库

生命奥秘 www.lifeomics.com 18 生命奥秘 www.lifeomics.com 18 表4 肿瘤成像的定量表5 大肠中GFP标记的肿瘤全身成像与活体内成像的比较肿瘤部位像素 mm2 GFP 脑部 912 6.00 RFP 脑部 811 5.34 GFP 骨 3561 23.42 GFP 大肠（全身成像） 2465 16.22 GFP 大肠（活体内成像） 2731 17.97 GFP 胰腺 2813 18.51 RFP 肝脏 2254 14.83 RFP 胰腺 25103 165.15 成像类型肿瘤大小（像素）荧光强度全身成像 2465 137 剖开后成像 2731 196 资料来源：BioTechniques 资料来源：BioTechniques 以上表明，在动物体内用GFP或RFP等标记的肿瘤能够发射出很强的信号，获得的图像可以很容易定量，自发荧光的干扰可以忽略，并且可以用简单的低成本的设备进行GFP和RFP的全身成像。所有这些表明，荧光蛋白在肿瘤研究及体内高通量药物筛选等其它方面有广阔的应用前景。 1. Anna-Katerina Hadjantonakis, Andras Nagy. (2001) The color of mice: in the light of GFP-variant reporters, Histochem Cell Biol, 115:49-58. 2. 刘忠华, 宋军, 王振坤等. (2008) 体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪,科学通报, 53(5): 556-560. 3. Meng Yang, George Luiken, Eugene Baranov, et al. (2005) Facile whole-body imaging of internal fluorescent tumors in mice with an LED flashlight, BioTechniques, 39: 170-172. 三、荧光蛋白技术的最新研究进展 1. 新增荧光蛋白在过去几年发展起来的荧光蛋白变体的荧光激发谱几乎覆盖了整个可见光的光谱范围。发色团周围环境的变化，如带电氨基酸残基的位置、氢键网络及蛋白间疏水作用等可能产生蓝色或红色光谱漂移，经吸收和激发后最大可漂移40nm。更大的光谱漂移会产生新的光谱型荧光蛋白，如CFP、GFP、YFP等，这是由于发色团共价结构和外部轨道连接的不同（图20、21）。人们进一步研究荧光蛋白发色团的复杂特性，找到了关于多肽骨架结构与功能关系的线索，因此借助基因工程更精细的调整颜色变体，并扩大有用蛋白的光谱范围就变得更加容易了。参考文献

2.各种荧光蛋白的最新研究进展 2.1蓝色和蓝绿色荧光蛋白目前,虽然大多数研究人员把注意力集中于橙色到远红外光谱区域,但最近BFP和CFP变体在成像中的应用潜力出人意料地受到研究人员的关注。虽然EBFP是 Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一,但其亮度低、光稳定性差,使其很久以来没有引起多数研究者的注意。最近,有三个研究小组报道指出,改进的蓝色 Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比,亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为 Azurite (石青或蓝铜矿)、强力增强型蓝色荧光蛋白2( strongly enhanced blue fluorescent protein2,SBFP2) 及EBFP2(图22a),它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性,但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用,并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6- diamidino-2 phenylindole,DAP)一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体,而且这种突变不会影响它们的特性。更重要的是,亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2(表6),是EGFP在活细胞中FRET的很好的供体。 b p q 图22(a-1)单体荧光蛋白与靶蛋白融合蛋白的亚细胞定位。(a)EBFP2mito-N-7(人细胞色素C氧化酶∨亚基:线粒体):(b) cErulean- paxillin-N-22(鸡:粘着斑);(c) mTFPI- actin-C-7(人B-肌动蛋白:丝状肌动蛋白):(d) eMerald- keratin-N-17(人细胞角蛋白18:中间丝):(e)超折叠GFP- lamin B1-C-10 人核纤层蛋白B1:核被膜):(f) mEnus-Cx43-N-7(大鼠α-1间隙连接蛋白-43;间隙连接):(g)YPet- N-7(人微管相关蛋白:RP/EB家族):(h)mKo- Golgi-N-7(人B-1,4半乳糖基转移酶N-末端 R基复合体);(i) td Tomato- zyxin-N-7(人斑联蛋白:粘着斑) Tag RFP-tubulin-C-6 管蛋白:微管):(k) mCherry-vimentin-N-7(人波形蛋白:中间丝);() mPlum-a- actinin-N-19(人非肌肉:细胞骨架);(mq) mEGFP与人组蛋白HB融合( mEGFP-H2B-N-6)。(m)间期:(n)前期:(o)前中期:(p)中期:(q)后期。(图片来源: Journal of Cell Science)

21 图22 （a-l）单体荧光蛋白与靶蛋白融合蛋白的亚细胞定位。（a）EBFP2-mito-N-7（人细胞色素C氧化酶VIII亚基；线粒体）；（b）mCerulean-paxillin-N-22（鸡；粘着斑）；（c）mTFP1-actin-C-7（人β-肌动蛋白；丝状肌动蛋白）；（d）mEmerald-keratin-N-17（人细胞角蛋白18；中间丝）；（e）超折叠GFP-lamin B1-C-10 （人核纤层蛋白B1；核被膜）；（f）mVenus-Cx43-N-7（大鼠α-1间隙连接蛋白-43；间隙连接）；（g）YPetEB3-N-7（人微管相关蛋白；RP/EB家族）；（h）mKO-Golgi-N-7（人β-1, 4半乳糖基转移酶N-末端81个氨基酸；高尔基复合体）；（i）tdTomato-zyxin-N-7（人斑联蛋白；粘着斑）；（j）TagRFP-tubulin-C-6（人α-微管蛋白；微管）；（k） mCherry-vimentin-N-7（人波形蛋白；中间丝）；（l）mPlum-α-actinin-N-19（人非肌肉；细胞骨架）; （m-q）mEGFP与人组蛋白H2B融合（mEGFP-H2B-N-6）。（m）间期；（n）前期；（o）前中期；（p）中期；（q）后期。（图片来源：Journal of Cell Science） 2. 各种荧光蛋白的最新研究进展 2.1 蓝色和蓝绿色荧光蛋白目前，虽然大多数研究人员把注意力集中于橙色到远红外光谱区域，但最近BFP和CFP变体在成像中的应用潜力出人意料地受到研究人员的关注。虽然EBFP是Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一，但其亮度低、光稳定性差，使其很久以来没有引起多数研究者的注意。最近，有三个研究小组报道指出，改进的蓝色Aequorea荧光蛋白变体与EBFP相比，亮度和光敏感性有明显增强。这些新的变体被命名为Azurite （石青或蓝铜矿）、强力增强型蓝色荧光蛋白2（strongly enhanced blue fluorescent protein 2, SBFP2）及EBFP2（图22a），它们第一次使得活细胞在蓝色光谱区域成功地长时间成像成为可能。即使这三种荧光蛋白在高浓度的微环境中表现出很弱的二聚体特性，但是它们能够在与亚细胞定位的靶蛋白融合中有效地发挥作用，并且它们能够很容易地通过滤光片设备与标准的BFP及4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2- phenylindole, DAPI）一起成像。所有这些BFP变体都可以通过A206K突变改造成真正的单体，而且这种突变不会影响它们的特性。更重要的是，亮度最强、光稳定性最强的蓝色荧光蛋白EBFP2（表6），是EGFP在活细胞中FRET的很好的供体。 a b c d e f g h i j k l m n o p q

生命奥秘 w w w . l i f e o m i c s . c o m 22 生命奥秘 w w w . l i f e o m i c s . c o m 22 蓝绿光谱区域（约 4 7 0 n m ~ 5 0 0 n m ）一直是原始的 Aeq uorea E C F P （表 6 ）衍生物占优势，直到一个单体的水鸭色（又称水鸭蓝，是蓝色与绿色正中的颜色）变体 m T F P 1 （图 2 2 c ）出现。这种荧光蛋白亮度更强，具有酸不敏感性，而且光稳定性更强。来源于四聚体软珊瑚蛋白的 m T F P 1 光谱特性与大多数 C F P 相比，有稍微的红移，所以命名为水鸭色而不是蓝绿色。与其它 C F P 不同， m T F P 1 在发色团的第 6 6 位氨基酸是酪氨酸而不是通常的色氨酸。酪氨酸代替色氨酸，使得荧光激发光谱宽度从大约 6 0 n m 降低到更容易操作的 3 0 n m ，这样就降低了多色实验和 F R E T 实验中的色度亮度干扰效应。当蓝绿色荧光蛋白与黄色或橙色荧光蛋白组合使用时， m T F P 1 （表 6 ）作为一个 F R E T 的供体，就成为除了 m E C F P 和 m C e r u l e a n （蔚蓝色或天蓝色荧光蛋白）（图 2 2 b ，表 6 ）之外的一个极好的选择。虽然说 m T F P 1 需要特殊的滤光片设备来成像，但是用标准的 E C F P 滤光片设备也能产生合适的信号水平。最近，应用一种更好的点直接突变方法进行 E C F P 和 E Y F P 单体变体的突变优化，以增强亮度、折叠效率、可溶性及 F R E T 性能。这样就产生了超级蓝绿色和黄色荧光衍生物，它们分别被命名为 S C F P 和 S Y F P 。在细菌中表达的这两种荧光蛋白明显要比原荧光蛋白亮度更强，但在哺乳动物细胞中表达的亮度却比原荧光蛋白弱两倍。不过，这些高性能的荧光蛋白应该有利于融合标签，能够用来创造新的更先进的且具有更大动态范围的 C F P - Y F P F R E T 生物传感器，用来检测代谢、 p H 变化、 C a 2 + 波动、蛋白质和酶磷酸化及其它细胞内的生物活动。蛋白光谱型颜色激发峰（nm）发射峰（nm）亮度光稳定性 pKa 聚集状态发色团滤光装置 EBFP2 蓝色 383 448 18 55 5.3 弱二聚体 SHG DAPI/BFP ECFP 蓝绿色 433/445 475/503 13 64 4.7 弱二聚体 TWG CFP mCerulean 蓝绿色 433/445 475/503 27/24 36 4.7 单体 TWG CFP mTFP1 蓝绿-绿色 462 492 54 110 4.3 单体 AYG CFP mEGFP 绿色 488 507 34 174 6.0 单体 TYG FITC/GFP mEmerald 绿色 487 509 39 101 6.0 单体 TYG FITC/GFP sfGFP 绿色 485 510 54 157 5.5 弱二聚体 TYG FITC/GFP EYFP 黄色 514 527 51 60 6.9 弱二聚体 GYG FITF/YFP mVenus 黄色 515 528 53 15 6.0 单体 GYG FITC/YFP mCitrine 黄色 516 529 59 49 5.7 单体 GYG FITC/YFP YPet 黄色 517 530 80 49 5.6 弱二聚体 GYG FITC/YFP mKO 橙色 548 559 31 122 5.0 单体 CYG TRITC/DsRed tdTomato 橙色 554 581 95 98 4.7 T二聚体 MYG TRITC/DsRed TagRFP 橙色 555 584 48 37 <4.0 单体 MYG TRITC/DsRed mRFP1 红色 584 607 12.5 8.7 4.5 单体 QYG TxRed mCherry 红色 587 610 17 96 <4.5 单体 MYG TxRed mKate 远红外 588 635 15 166 6.0 单体 MYG TxRed mPlum 远红外 590 649 3.2 53 <4.5 单体 MYG TxRed 表6 常用荧光蛋白的物理属性资料来源：Journal of Cell Science

22绿色荧光蛋白在光谱的绿光区(500nm-525nm)已经发现了多种荧光蛋白,而且来源广泛,包括不同种属的 Aequorea、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应,即使最好的荧光蛋白与EGFP相比,也没有明显的优点(表6;图22m-q)。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的 Emerald(祖母绿)(图 22d),它与EGFP的特性相似。 Emerald包含F64L和S65T突变,另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃ 时的突变率以及亮度。虽然 Emerald比EGFP更有效,但含有快速光漂白成分,可能在某些环境下其定量成像会受到影响。过去几年,关于GFP最重大的进展是超折叠GFP(图22e)的发现,即使与不溶性蛋白质融合表达仍然可以高效地折叠而且比EGFP和 Emerald的亮度更强、耐酸性更好(表6)。然而,需要注意的是, 超折叠GFP可能会产生较高的背景干扰,不过它仍能产生亮度较强的荧光 2.3黄色荧光蛋白作为一种光谱型,黄色荧光蛋白已经被开发成亮度最亮及最通用的遗传编码探针。然而最早的变体 EYFP(表6)虽然仍被广泛应用,但由于其pKa值高、对卤化物敏感,导致EYFP的应用还很不理想。单体形式的变体柠檬黄( cItrine)和维纳斯( mEnus)(图22f)是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针(表 6),但二者都还没有商业化。然而与之相似的,来源于 Aequorea被命名为诞生石 Topaz(黄玉)的变体可人 nitrogen公司买到。另外,一旦新开发的SYFP在哺乳动物细胞中能够融合表达并得到证实,一定会成为种有用的黄色荧光蛋白另一种很有应用潜力的黄色荧光蛋白是能量转移黄色荧光蛋白( yellow fluorescent protein for energy transfer,YPet),它经合成的DNA重排获得,与荧光激活的细胞分选术结合能够增强FRET中蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的配对。YPet是已经开发的亮度最强的黄色荧光蛋白,并且有很好的光稳定性(图22g, 表6)。YPet对酸性环境的耐受性要比 mEnus及其它黄色荧光蛋白变体强,这将拓宽这种探针在研究酸性细胞器的生物传感器中的应用。虽然YPet对FRET是最优化的,但仍存在一个很大的疑问,就是YPet具有如此好的特性的原因,或许仅是由于YPet与 CyPeti的二聚化作用得到增强。 2.4橙色荧光蛋白与数以百计的蓝绿色、绿色及黄色光谱型荧光蛋白相比,在橙色和红色波长(约560nm到650nm)光谱区仅仅开发了几种探针。尽管如此,现有的这几种光谱型的蛋白(图21,表6)都是从珊瑚中分离得到的, 并且在多种成像情景中显现出应用潜力,但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。通常被命名为红色荧光蛋白RFP的探针如 DsRed、 TagRFP及 td Tomato,实际上具有明显的橙色多于红色的发射谱。不考虑颜色的指示,用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂( tetramethy- rhodamine isothiocyanate,TRTC)滤光片设备, 橙色光谱型的蛋白在多种颜色,如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。 Kusabira Orange是来源于香菇珊瑚 Fungia concinna的四聚体,它通过cDNA克隆的点特异性突变在蛋白质的N末端添加了10个残基。得到的荧光蛋白在548nm有最大吸收,发射光谱以559m为中心发出亮的黄橙色荧光。随后再另外引入20个突变,得到单体形式的mKo(图2h,表6)。mKO表现出与EGFP相似的亮度,并且在更广泛的荧光发射范围都具有光稳定性,是所有荧光蛋白中最好的,所以它是长期成像实验中的最佳选择。更重要的是,mKo消光系数高,使它成为FRET中蓝绿色和水鸭绿色荧光蛋白的极好受体。现在 Kusabira Orange的四聚体和单体变体都已经商业化最近,研究人员引进了一种新的高亮度的单体橙色蛋白 TagRFP,在定位研究和FRET研究中是很有希望的候选物。人们最早是从海葵 Entacmaea guadricolor中克隆到其二聚体形式,随后的随机突变产生种快速成熟变体 TurboRFP,其特点是光稳定性高、亮度强、pH耐受性高等。在来自相同种属的相近蛋白 (eqFP6l1,图21)的晶体结构基础上, Merzlyak等在二聚体中替换了几个关键的氨基酸残基,同时进行随机突变以保留蛋白的折叠特性。最终得到的变体 TagRFP具有很好的光物理学特性(表6),并且能在哺乳动

23 2.2 绿色荧光蛋白 2.3 黄色荧光蛋白 2.4 橙色荧光蛋白在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的 Aequorea、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点（表6；图22 m-q）。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿）（图 22d），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃ 时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。过去几年，关于GFP最重大的进展是超折叠GFP（图22e）的发现，即使与不溶性蛋白质融合表达仍然可以高效地折叠而且比EGFP和Emerald的亮度更强、耐酸性更好（表6）。然而，需要注意的是，超折叠GFP可能会产生较高的背景干扰，不过它仍能产生亮度较强的荧光。作为一种光谱型，黄色荧光蛋白已经被开发成亮度最亮及最通用的遗传编码探针。然而最早的变体 EYFP（表6）虽然仍被广泛应用，但由于其pK a值高、对卤化物敏感，导致EYFP的应用还很不理想。单体形式的变体柠檬黄（mCitrine）和维纳斯（mVenus）（图22f）是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针（表 6），但二者都还没有商业化。然而与之相似的，来源于Aequorea被命名为诞生石Topaz（黄玉）的变体可从Invitrogen公司买到。另外，一旦新开发的SYFP在哺乳动物细胞中能够融合表达并得到证实，一定会成为一种有用的黄色荧光蛋白。另一种很有应用潜力的黄色荧光蛋白是能量转移黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein for energy transfer, YPet），它经合成的DNA重排获得，与荧光激活的细胞分选术结合能够增强FRET中蓝绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的配对。YPet是已经开发的亮度最强的黄色荧光蛋白，并且有很好的光稳定性（图22g，表6）。YPet对酸性环境的耐受性要比mVenus及其它黄色荧光蛋白变体强，这将拓宽这种探针在研究酸性细胞器的生物传感器中的应用。虽然YPet对FRET是最优化的，但仍存在一个很大的疑问，就是YPet具有如此好的特性的原因，或许仅是由于YPet与CyPet的二聚化作用得到增强。与数以百计的蓝绿色、绿色及黄色光谱型荧光蛋白相比，在橙色和红色波长（约560nm到650nm）光谱区仅仅开发了几种探针。尽管如此，现有的这几种光谱型的蛋白（图21，表6）都是从珊瑚中分离得到的，并且在多种成像情景中显现出应用潜力，但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。通常被命名为红色荧光蛋白RFP的探针如DsRed、TagRFP及tdTomato，实际上具有明显的橙色多于红色的发射谱。不考虑颜色的指示，用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）滤光片设备，橙色光谱型的蛋白在多种颜色，如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。 Kusabira Orange是来源于香菇珊瑚Fungia concinna的四聚体，它通过cDNA克隆的点特异性突变在蛋白质的N末端添加了10个残基。得到的荧光蛋白在548nm有最大吸收，发射光谱以559nm为中心发出亮的黄- 橙色荧光。随后再另外引入20个突变，得到单体形式的mKO（图22h，表6）。mKO表现出与EGFP相似的亮度，并且在更广泛的荧光发射范围都具有光稳定性，是所有荧光蛋白中最好的，所以它是长期成像实验中的最佳选择。更重要的是，mKO消光系数高，使它成为FRET中蓝绿色和水鸭绿色荧光蛋白的极好受体。现在 Kusabira Orange的四聚体和单体变体都已经商业化。最近，研究人员引进了一种新的高亮度的单体橙色蛋白TagRFP，在定位研究和FRET研究中是很有希望的候选物。人们最早是从海葵Entacmaea quadricolor中克隆到其二聚体形式，随后的随机突变产生一种快速成熟变体TurboRFP，其特点是光稳定性高、亮度强、pH耐受性高等。在来自相同种属的相近蛋白（eqFP611，图21）的晶体结构基础上，Merzlyak等在二聚体中替换了几个关键的氨基酸残基，同时进行随机突变以保留蛋白的折叠特性。最终得到的变体TagRFP具有很好的光物理学特性（表6），并且能在哺乳动

生命奥秘 ww.lifeomics com 物细胞中与多种蛋白融合表达(图22j)。然而 (sef- association,文后小词典)的倾向,同时将有些实验室发现其光稳定性不如原来描述的那样发射峰推进到更长的波长区域高。 Merzlyak等推测,当GFP和YFP作为供体时在所有光谱型中,亮度最强的荧光蛋白是 TagRFP将成为极好的FRET受体,但这仍需要进串联形式的二聚体 Tomato( dimeric Tomato 步验证 d Tomato)。它是一种原始的水果蛋白的橙色衍生通过点特异性和随机突变,人们已经解决了原物。 d Tomato来源于一种被命名为dmer2的中间始 Discosoma dsred荧光蛋白的主要问题。但是体,这种中间体是在四聚体 DsRed蛋白崩解过程要从其它种属的珊瑚虫蛋白构建真正的单体 Ds Red中产生的。这种变体包含GFP的N末端和C末端的变体,却是一项困难的任务。要得到第一代单体前后各七个氨基酸残基,这样可以提高与融合蛋白红色荧光蛋白(mRFP1),需要改造 DsRed序列的兼容性并降低潜在的定位假象。串联二聚体包含的33个残基。mRFP1在584nm吸收最大,发射谱 d Tomato的两个拷贝,由12个氨基酸残基的接头链 607nm。然而,与天然蛋白相比,这种衍生物表现接。由于有一对发色团,导致 td Tomato(图22i) 出明显的荧光发射减弱以及很快的光漂白,这导致亮度极强并且有得天独厚的光稳定性(表6)。其比类似的单体GFP和YFP用处要小得多。研究 td Tomato最大的缺点是分子较大,在某些情况下可人员利用突变技术来寻找橙色、红色和远红外的荧能会干扰融合蛋白的折叠。光蛋白变体,进一步降低这些生物探针的自缔合 2.5红色荧光蛋白在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的的荧光蛋白,这表明首次获得了真正的远红外基因红色荧光蛋白,主要是由于在多种颜色成像实验中工程探针(发射波长为625nm及649nm)。其中最需要红色探针,另外基于较长的激发波长产生的光有应用潜力的是mPum(图22),虽然其亮度有毒性较小,可以用来探测较深的生物组织。最新研限仅为EGFP的10%(表6),但它有极好的光稳究进展是,通过mRFP1(表6)发色团残基的直接定性。mPum可与蓝绿色、绿色、黄色及橙色荧突变产生的新的荧光蛋白,得到的单体荧光蛋白发光蛋白一起应用于多色成像实验中,也可在FRET 射峰在560nm~610nm,并以相应的水果名字来命中与绿色和黄色荧光蛋白如 eMerald(表6)、 m citrine配对使用这其中 sTrawberry和 mCherry,发射峰分 Chudakov等人在2007年组合应用点特异性突别为596nm和610nm(表6,图22k),亮度分别变和随机突变得到了编码 TurboRFP变体的库,它为EGFP的75%和50%左右。 mCherry的光稳定性包含了发色团周围关键位点的突变。经过筛选及进要远强于 sTrawberry,所以长期成为成像实验中步突变,人们最后获得了一种二聚体蛋白,并将 mRFP1最好的替代品。这些以水果命名的荧光蛋白其命名为 Katushka(发射峰为635nm)。虽然亮度单体与mKO和 TagRFP共同填补了水母红移荧光蛋仅为EGFP的三分之二,但 Katushka是650-800nm 白(如YPet)与大量低聚红色珊瑚荧光蛋白间的空光谱区亮度最强的荧光蛋白,此区域对较深的组白,并且目前已经商业化。虽然,某些荧光蛋白缺织成像非常重要。将 Katushka的四个主要突变引乏许多成像实验所需要的亮度和光稳定性,但是它 TagRFP,产生的一种单体的远红外蛋白mKae 们的存在提示我们,最终可以找到跨越整个可见光(表6)具有相似的光谱特点。研究表明, mKate 谱的亮度高、稳定性强的单体探针。的光稳定性是个例外,其亮度与 mCherry类似,这研究人员借助一种新技术迭代体细胞超突变使得它成为在远红外光谱区成像的定位实验中极好 ( somatic hypermutation,SMH),获得了两种新的选择。 24

生命奥秘 www.lifeomics.com 24 生命奥秘 www.lifeomics.com 24 物细胞中与多种蛋白融合表达（图22j）。然而，有些实验室发现其光稳定性不如原来描述的那样高。Merzlyak等推测，当GFP和YFP作为供体时， TagRFP将成为极好的FRET受体，但这仍需要进一步验证。通过点特异性和随机突变，人们已经解决了原始Discosoma DsRed荧光蛋白的主要问题。但是要从其它种属的珊瑚虫蛋白构建真正的单体DsRed 变体，却是一项困难的任务。要得到第一代单体红色荧光蛋白（mRFP1），需要改造DsRed序列的33个残基。mRFP1在584nm吸收最大，发射谱 607nm。然而，与天然蛋白相比，这种衍生物表现出明显的荧光发射减弱以及很快的光漂白，这导致其比类似的单体GFP和YFP用处要小得多。研究人员利用突变技术来寻找橙色、红色和远红外的荧光蛋白变体，进一步降低这些生物探针的自缔合（self-association，文后小词典）的倾向，同时将发射峰推进到更长的波长区域。在所有光谱型中，亮度最强的荧光蛋白是串联形式的二聚体Tomato（dimeric Tomato, dTomato）。它是一种原始的水果蛋白的橙色衍生物。dTomato来源于一种被命名为dimer2的中间体，这种中间体是在四聚体DsRed蛋白崩解过程中产生的。这种变体包含GFP的N末端和C末端的前后各七个氨基酸残基，这样可以提高与融合蛋白的兼容性并降低潜在的定位假象。串联二聚体包含 dTomato的两个拷贝，由12个氨基酸残基的接头链接。由于有一对发色团，导致tdTomato（图22i）亮度极强并且有得天独厚的光稳定性（表6）。 tdTomato最大的缺点是分子较大，在某些情况下可能会干扰融合蛋白的折叠。 2.5 红色荧光蛋白在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。最新研究进展是，通过mRFP1（表6）发色团残基的直接突变产生的新的荧光蛋白，得到的单体荧光蛋白发射峰在560nm～610nm，并以相应的水果名字来命名。这其中mStrawberry和mCherry，发射峰分别为596nm和610nm（表6，图22k），亮度分别为EGFP的75%和50%左右。mCherry的光稳定性要远强于mStrawberry，所以长期成为成像实验中 mRFP1最好的替代品。这些以水果命名的荧光蛋白单体与mKO和TagRFP共同填补了水母红移荧光蛋白（如YPet）与大量低聚红色珊瑚荧光蛋白间的空白，并且目前已经商业化。虽然，某些荧光蛋白缺乏许多成像实验所需要的亮度和光稳定性，但是它们的存在提示我们，最终可以找到跨越整个可见光谱的亮度高、稳定性强的单体探针。研究人员借助一种新技术迭代体细胞超突变（somatic hypermutation, SMH），获得了两种新的荧光蛋白，这表明首次获得了真正的远红外基因工程探针（发射波长为625nm及649nm）。其中最有应用潜力的是mPlum（图22l），虽然其亮度有限仅为EGFP的10%（表6），但它有极好的光稳定性。mPlum可与蓝绿色、绿色、黄色及橙色荧光蛋白一起应用于多色成像实验中，也可在FRET 中与绿色和黄色荧光蛋白如mEmerald（表6）、 mCitrine配对使用。 Chudakov等人在2007年组合应用点特异性突变和随机突变得到了编码TurboRFP变体的库，它包含了发色团周围关键位点的突变。经过筛选及进一步突变，人们最后获得了一种二聚体蛋白，并将其命名为Katushka（发射峰为635nm）。虽然亮度仅为EGFP的三分之二，但Katushka是650-800nm 光谱区亮度最强的荧光蛋白，此区域对较深的组织成像非常重要。将Katushka的四个主要突变引入TagRFP，产生的一种单体的远红外蛋白mKate （表6）具有相似的光谱特点。研究表明，mKate 的光稳定性是个例外，其亮度与mCherry类似，这使得它成为在远红外光谱区成像的定位实验中极好的选择

2.6光学加亮荧光蛋白人们在对荧光蛋白变体复杂的光物理学特性缺陷。然而,这一点对于建立一个较大的光活化动的研究,找到了可被两种方式激活的发色团,它们力学范围是至关重要的。在 Emerald和超折叠GFP 可从静息态发射荧光(即光激活)或者发生荧光发基础上开发的类似荧光蛋白动力学范围被降低,这射带宽的转变(即光转化)。这些蛋白出现后被作或许是因为非活化状态下的荧光强度明显要比PA 为一种新型的探针,在活细胞成像中及对蛋白质动GFP亮。力学的研究中最为理想。如表7,理想的光学加亮来源于水母 Aequorea coerulescens的一种新荧光蛋白应易于光激活或光转化以产生更高水平的蛋白质PS-CFP2,就是在405nm照射下发生光转化对比,以单体形式作为融合标签。这些为相对苛刻从蓝绿色变成绿色荧光的(表7)。这种光学加亮的光漂白技术提供了一个温和的选择,如光脱色荧的荧光蛋白与PA-GFP有相同的发色团,可能是通光恢复技术( fluorescence recovery after photo-过类似的机制进行光活化的(图23a)。PS-CFP2 bleaching,FRAP)和光漂白过程中的荧光损失与 PA-GFP相比有一优势,在光转化前会发出有效 ( fluorescence loss in photobleaching, FLIP) 的蓝绿色荧光,这就更容易追踪和定位。然而PS 它们需要强的激光并反复照射,以便从感兴趣的区cFP2的动力学范围要比 PA-GFP低,这种探针在光域完全清除活化的光团。更重要的是新合成的或未转化效率上不如绿色到红色光学加亮的荧光蛋白转化的荧光蛋白并未对它们产生消极的影响,它们所有已经报道的绿色到红色光学加亮的荧光仍然是不可见的或继续发射原有的波长。蛋白(包括 Dendra2、Eos、 Kaede和 KikGR,表第一个可光活化的( photoactivatable,PA)7),都有一个能发出绿色荧光的来源于三肽HYG 光学加亮 PA-GFP(图23a,表7),就是通过将的发色团。用短波长的可见光或长波长的紫外线 wtGFP的203位苏氨酸替换为组氨酸(T203H)而照射,就会引起酰胺氮和组氨酸残基的a碳原子产生的只有被激活才发出绿色荧光的变体。用强烈断开,接下来发色团会连接到组氨酸支链上(图的紫色光(390-15nm)照射,这个变体产生的绿23b)。这一过程需要完整蛋白的催化作用,结果色荧光(发射峰在504nm)提高了100倍,从而可荧光发射向着长波长(橙色-红色)漂移。这种包括以用来追踪分子亚群动力学(图24a-c)。 PA-GFP发色团转变的非常规的化学反应,为开发更好的加的非活化形式很难被检测到,这或许是它最大的亮荧光蛋白提供了很好的基础。表7常用光学加亮荧光蛋白物理属性蛋白光谱型颜色数默发亮度叭,聚集状态发色团滤光装置 PA-GFP(N)绿色4015 45弱二聚体 SYG DAF|FTc PA-GFP(P)绿色 45弱三聚体 SYGFITC/GFP PS-CFP2(N)蓝绿色 8.6 SYG CFP PS-CFP2(P)绿色 1110.861单体 SYG FITCIGFP PA-mRFP(P)红色 578 单体 QYG TXRed teOs(N)绿色 516 5545.5串联二聚体 HYGFITC/GFP teOs (P) 红色 58 1985.5串联二聚体 HYGTRITC Dendra()绿色 .6 体 HYG FITC/GFP Dendra2(P)红色 19.36.9单体 HYG TRITC 红色 600 41NA四聚体 MYGTRITC/DsRed Dronpa(P) 绿色 503 1880.85.0单体 CYGFITC/GFP N:天然构象:P:光活化或光转化后构象。资料来源: Journa/ofce∥ Science

25 2.6 光学加亮荧光蛋白人们在对荧光蛋白变体复杂的光物理学特性的研究，找到了可被两种方式激活的发色团，它们可从静息态发射荧光（即光激活）或者发生荧光发射带宽的转变（即光转化）。这些蛋白出现后被作为一种新型的探针，在活细胞成像中及对蛋白质动力学的研究中最为理想。如表7，理想的光学加亮荧光蛋白应易于光激活或光转化以产生更高水平的对比，以单体形式作为融合标签。这些为相对苛刻的光漂白技术提供了一个温和的选择，如光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching, FRAP）和光漂白过程中的荧光损失（fluorescence loss in photobleaching, FLIP），它们需要强的激光并反复照射，以便从感兴趣的区域完全清除活化的光团。更重要的是新合成的或未转化的荧光蛋白并未对它们产生消极的影响，它们仍然是不可见的或继续发射原有的波长。第一个可光活化的（photoactivatable, PA）光学加亮PA-GFP（图23a，表7），就是通过将 wtGFP的203位苏氨酸替换为组氨酸（T203H）而产生的只有被激活才发出绿色荧光的变体。用强烈的紫色光（390-415nm）照射，这个变体产生的绿色荧光（发射峰在504nm）提高了100倍，从而可以用来追踪分子亚群动力学（图24 a-c）。PA-GFP 的非活化形式很难被检测到，这或许是它最大的蛋白光谱型颜色激发峰（nm）发射峰（nm）亮度 pKa 聚集状态发色团滤光装置 PA-GFP(N) 绿色 400 515 2.7 4.5 弱二聚体 SYG DAPI/FITC PA-GFP(P) 绿色 504 517 13.8 4.5 弱二聚体 SYG FITC/GFP PS-CFP2(N) 蓝绿色 400 468 8.6 4.3 单体 SYG CFP PS-CFP2(P) 绿色 490 511 10.8 6.1 单体 SYG FITC/GFP PA-mRFP1(P) 红色 578 605 0.8 4.4 单体 QYG TxRed tdEos（N）绿色 506 516 55.4 5.5 串联二聚体 HYG FITC/GFP tdEos（P）红色 569 581 19.8 5.5 串联二聚体 HYG TRITC Dendra2(N) 绿色 490 507 22.5 6.6 单体 HYG FITC/GFP Dendra2(P) 红色 553 573 19.3 6.9 单体 HYG TRITC KFP1(P) 红色 580 600 4.1 NA 四聚体 MYG TRITC/DsRed Dronpa(P) 绿色 503 518 80.8 5.0 单体 CYG FITC/GFP 缺陷。然而，这一点对于建立一个较大的光活化动力学范围是至关重要的。在Emerald和超折叠GFP 基础上开发的类似荧光蛋白动力学范围被降低，这或许是因为非活化状态下的荧光强度明显要比PAGFP亮。来源于水母Aequorea coerulescens的一种新蛋白质PS-CFP2，就是在405nm照射下发生光转化从蓝绿色变成绿色荧光的（表7）。这种光学加亮的荧光蛋白与PA-GFP有相同的发色团，可能是通过类似的机制进行光活化的（图23a）。PS-CFP2 与PA-GFP相比有一优势，在光转化前会发出有效的蓝绿色荧光，这就更容易追踪和定位。然而PSCFP2的动力学范围要比PA-GFP低，这种探针在光转化效率上不如绿色到红色光学加亮的荧光蛋白。所有已经报道的绿色到红色光学加亮的荧光蛋白（包括Dendra2、Eos、Kaede和KikGR，表 7），都有一个能发出绿色荧光的来源于三肽HYG 的发色团。用短波长的可见光或长波长的紫外线照射，就会引起酰胺氮和组氨酸残基的α碳原子断开，接下来发色团会连接到组氨酸支链上（图 23b）。这一过程需要完整蛋白的催化作用，结果荧光发射向着长波长（橙色-红色）漂移。这种包括发色团转变的非常规的化学反应，为开发更好的加亮荧光蛋白提供了很好的基础。表7 常用光学加亮荧光蛋白物理属性 N：天然构象；P：光活化或光转化后构象。资料来源：Journal of Cell Science

生命奥秘 ww.lifeomics com 光活化 406nm 中性型e65 阴离子型天然类 Glu222 光活化类 (暗的) (绿色) G|u222 去碳酸基 Tyr63 Tyr63 Gly 64 光活化 Gly64 405 nm 天然类光活化类 (红色) 骨架被劈开 (绿色) His62 反式发色团顺式发色团光控开关 Gly64 405 nm Gly64 顺反异构 488 nm Tyro c Cys62 荧光图23光学加亮荧光蛋白光活化、光转化和光控的机制。(a) PA-GFP和PS-CFP2的光活化是当发色团由中性转变为阴离子态而导致22位谷氨酸脱羧基引起的。(b)包含HYG发色团的 Kaede、KkGR、 Dendra2和Eos,它们的绿色到红色的光转化,紫外或紫色光照射后引起62位组氨酸残基的酰胺氮与a-碳原子间连接断裂,形成一个相连的双咪唑环系统。(c) Dronpa的光控是照射光在405mm和488nm间转换引起的顺反式光异构化。mTFP0.7 和KFP1的异构化机制与此相似。(图片来源: Journal of Cel∥ Science) 遗憾的是,光学加亮的荧光蛋白的全部潜能还远远没有被认识到。在现有的几种光活化探针中,PA GFP仍然是绿色荧光区最好的选择,而且在动力学范围方面远优于红色变体PA-mRFP1。 PS-CFP2是蓝绿到绿色光转化的唯一选择, PS-CFP2虽然以单体形式存在,但其亮度低,而且在成像过程中会因持续的光转化而造成伪像。在绿色到红色类型中,在亮度和转化效率方面表现最好的是 Kaede和KkGR。然而二者都是四聚体,在大多数实验中都不能应用。 Dendra2是单体变体,或许在感光融合及FRET研究中是最好的选择(图 24gi)。但是由于在激光扫描共聚焦成像中,快速光漂白使其亮度不到四聚体的50%。绿色到红色光加亮荧光蛋白Eos的二聚体在亮度及光稳定性方面比 Dendra2要好,但体积大两倍(图24 很明显,所有的种类都需要进一步找到更好的荧光蛋白。来源于 Pectinidae(一种石化珊瑚虫)的单体荧光蛋白 Dronpa的产生,宣告了新一代专门的开-关可控的可逆光学加亮荧光蛋白的产生。 Dronpa是经过定向和随机突变的基因工程改构获得的,表现出非同寻常的光致变色,用两种不同激发波长照射可使其开启或关闭荧光(图23c和图244)。 Dronpa在503nm有一个最大

生命奥秘 www.lifeomics.com 26 生命奥秘 www.lifeomics.com 26 a b c 中性型光活化光活化天然类（暗的）天然类（绿色）顺反异构反式发色团光控开关顺式发色团暗态荧光态阴离子型光活化类（绿色）光活化类（红色）骨架被劈开去碳酸基图23 光学加亮荧光蛋白光活化、光转化和光控的机制。（a）PA-GFP和PS-CFP2的光活化是当发色团由中性转变为阴离子态而导致222位谷氨酸脱羧基引起的。（b）包含HYG发色团的Kaede、KikGR、Dendra2和Eos，它们的绿色到红色的光转化，紫外或紫色光照射后引起62位组氨酸残基的酰胺氮与α-碳原子间连接断裂，形成一个相连的双咪唑环系统。（c）Dronpa的光控是照射光在405nm和488nm间转换引起的顺-反式光异构化。mTFP0.7 和KFP1的异构化机制与此相似。（图片来源：Journal of Cell Science）遗憾的是，光学加亮的荧光蛋白的全部潜能还远远没有被认识到。在现有的几种光活化探针中，PAGFP仍然是绿色荧光区最好的选择，而且在动力学范围方面远优于红色变体PA-mRFP1。PS-CFP2是蓝绿到绿色光转化的唯一选择，PS-CFP2虽然以单体形式存在，但其亮度低，而且在成像过程中会因持续的光转化而造成伪像。在绿色到红色类型中，在亮度和转化效率方面表现最好的是Kaede和KikGR。然而二者都是四聚体，在大多数实验中都不能应用。Dendra2是单体变体，或许在感光融合及FRET研究中是最好的选择（图 24 g-i）。但是由于在激光扫描共聚焦成像中，快速光漂白使其亮度不到四聚体的50%。绿色到红色光加亮荧光蛋白Eos的二聚体在亮度及光稳定性方面比Dendra2要好，但体积大两倍（图24 d-f）。很明显，所有的种类都需要进一步找到更好的荧光蛋白。来源于Pectiniidae（一种石化珊瑚虫）的单体荧光蛋白Dronpa的产生，宣告了新一代专门的开-关可控的可逆光学加亮荧光蛋白的产生。Dronpa是经过定向和随机突变的基因工程改构获得的，表现出非同寻常的光致变色，用两种不同激发波长照射可使其开启或关闭荧光（图23c和图24j-l）。Dronpa在503nm有一个最大

吸收峰,在390nm处有一个次峰。主峰归因于去质下才发出荧光。低亮度的光导致瞬时红色荧光,其子化的发色团(阴离子型),而次峰产生于质子化最大激发和发射谱分别为580nm和600nm,随着照 (中性)形式的发色团。当在488nm照射时,阴离射的停止而慢慢地衰退,重新恢复到原来非荧光状子型的发色团在最大518nm发射,此时,相应的光态。用强烈的蓝光(450-490nm)照射,会立即完量子产率较高达到0.85(表7)。与此形成鲜明对照全地淬灭红色荧光,这使得荧光标记受到很好的控的是,中性形态的发色团几乎发不出荧光。 Dronpa制。相反,高强度的绿光(约550nm)照射或以中的光控开关就是去质子化与质子化形态的相互转等水平持续照射,结果导致不可逆的光转换,产生换。一旦在488nm受到照射, Dronpa就变成质子化强度比非活化蛋白强30倍的荧光。KFP1主要的缺形式,荧光减弱变暗即关闭状态,此时390nm吸收点是其强制性的四聚体,这严重地影响其作为融合峰占优势。在最低照度(405nm)下,能很容易地标签及其FRET中的应用令其从暗淡状态转换回原来的去质子化状态,发出荧光蛋白光控机制的研究表明,发色团顺-反荧光(图23c)。2007年,研究人员报道了水鸭绿异构体是开关过程的关键事件。顺式构象代表荧光荧光蛋白前体mTFP07类似的行为,从结晶学上描形态,而反式异构体为发色团的非荧光或暗状态述了其暗状态和荧光状态的转换 (图23c)。这些构象的改变很显然是伴随着发色日前,人们已经从 Anemonia sulcata分离到团各种各样的质子化作用。更重要的是,光诱导的种非荧光色素蛋白,开发出另一种光可控加亮荧光控可能是发色团平面性及其内部氨基酸支链结构光蛋白 Kindling荧光蛋白(商品名KFP1,表7)。重排的表现。这可能是各种光活化和光控荧光蛋白 KFP1只有在525nm和580nm间的绿色或黄色光照射基本的机制图24光学加亮荧光蛋白在激光扫描共聚焦显微镜下成像。(a-c)mPA GFP- actin-C-7在负鼠肾上皮细胞 OK细胞系)中的光活用 Olympus FV1000飓风扫描器选定的环状区域,在405nm照射5秒钟 (b)光活化的肌动蛋白嵌合体,时间为5分钟。(c)胞浆肌动蛋白池丝状肌动蛋白网,时间为60分钟 (d-f)跟踪兔肾上皮细胞(RK-13 405nm 靠近物质交换细胞系)中 teOs-mito-N-7标记的线粒体。(d)选定的区域中,单个线粒体(红色)在405nm光照下的光转化。(e)箭头所示为未转化的线粒体(绿色)向光转化的线粒体靠近时间为10分钟。(f)线粒体间的物质交换,时间为20分钟。(g-1)在 OK细胞中用 Dendra2-actn-C-7检测板状伪足回缩板状伪足。(g)用405nm激光选定域的光转化(红色)。(h)光转化肌动蛋白形成的伪足小体及其前缘的改变,时间为20分钟光转化的板状伪足回而促进新伪足小伪足小体伪足小体体和新前缘的形成,时间为45分钟新前缘 (1)大鼠胸主动脉成肌细胞(A7r5 细胞系)中 Dronpa- actin-C-7标记的肌动蛋白细胞骨架的光控开关肌动蛋白网在488nm激光下的成像 (k)完全光控开关后,标记的肌动蛋白在488m“关拼写有FV10的区域在405nm激光下被激活,时间为分钟。(1)肌动蛋白网在488nm成像时FV10区域被光漂白图片来源: Journal of cell science

27 图24 光学加亮荧光蛋白在激光扫描共聚焦显微镜下成像。（a-c）mPAGFP-actin-C-7在负鼠肾上皮细胞（OK细胞系）中的光活化。（a）用Olympus FV1000 飓风扫描器选定的环状区域，在405nm照射5秒钟。（b）光活化的肌动蛋白嵌合体，时间为5分钟。（c）胞浆肌动蛋白池和丝状肌动蛋白网，时间为60分钟。（d-f）跟踪兔肾上皮细胞（RK-13 细胞系）中tdEos-mito-N-7标记的线粒体。（d）选定的区域中，单个线粒体（红色）在405nm光照下的光转化。（e）箭头所示为未转化的线粒体（绿色）向光转化的线粒体靠近，时间为10分钟。（f）线粒体间的物质交换，时间为20分钟。（g-i）在 OK细胞中用Dendra2-actin-C-7检测板状伪足。（g）用405nm激光选定区域的光转化（红色）。（h）光转化肌动蛋白形成的伪足小体及其前缘的改变，时间为20分钟。（i）光转化的板状伪足回缩，从而促进新伪足小体和新前缘的形成，时间为45分钟。（j-l）大鼠胸主动脉成肌细胞（A7r5 细胞系）中Dronpa-actin-C-7标记的肌动蛋白细胞骨架的光控开关。（j）肌动蛋白网在488nm激光下的成像。（k）完全光控开关后，标记的肌动蛋白在488nm“关闭”，拼写有FV10的区域在405nm激光下被激活，时间为3 分钟。（l）肌动蛋白网在488nm成像时FV10区域被光漂白。图片来源：Journal of Cell Science 吸收峰，在390nm处有一个次峰。主峰归因于去质子化的发色团（阴离子型），而次峰产生于质子化（中性）形式的发色团。当在488nm照射时，阴离子型的发色团在最大518nm发射，此时，相应的光量子产率较高达到0.85（表7）。与此形成鲜明对照的是，中性形态的发色团几乎发不出荧光。Dronpa 的光控开关就是去质子化与质子化形态的相互转换。一旦在488nm受到照射，Dronpa就变成质子化形式，荧光减弱变暗即关闭状态，此时390nm吸收峰占优势。在最低照度（405nm）下，能很容易地令其从暗淡状态转换回原来的去质子化状态，发出荧光（图23c）。2007年，研究人员报道了水鸭绿荧光蛋白前体mTFP0.7类似的行为，从结晶学上描述了其暗状态和荧光状态的转换。目前，人们已经从Anemonia sulcata分离到一种非荧光色素蛋白，开发出另一种光可控加亮荧光蛋白Kindling荧光蛋白（商品名KFP1，表7）。 KFP1只有在525nm和580nm间的绿色或黄色光照射下才发出荧光。低亮度的光导致瞬时红色荧光，其最大激发和发射谱分别为580nm和600nm，随着照射的停止而慢慢地衰退，重新恢复到原来非荧光状态。用强烈的蓝光（450-490nm）照射，会立即完全地淬灭红色荧光，这使得荧光标记受到很好的控制。相反，高强度的绿光（约550nm）照射或以中等水平持续照射，结果导致不可逆的光转换，产生强度比非活化蛋白强30倍的荧光。KFP1主要的缺点是其强制性的四聚体，这严重地影响其作为融合标签及其FRET中的应用。荧光蛋白光控机制的研究表明，发色团顺-反异构体是开关过程的关键事件。顺式构象代表荧光形态，而反式异构体为发色团的非荧光或暗状态（图23c）。这些构象的改变很显然是伴随着发色团各种各样的质子化作用。更重要的是，光诱导的光控可能是发色团平面性及其内部氨基酸支链结构重排的表现。这可能是各种光活化和光控荧光蛋白基本的机制。靠近物质交换前缘新前缘伪足小体伪足小体板状伪足回缩 a g d j b h e k c i f l