《厦门大学学报（自然科学版）》：多肽18F标记方法研究进展（杨鸿章、牟钊彪、李子婧）.pdf_大学文库

doi:106043/issn.0438-0479202005009 多肽1F标记方法研究进展杨鸿章,牟钊彪,李子婧厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心,福建厦门361102) 摘要:正电子发射断层成像( positron emission tomography,PET)是高灵敏、可定量及无创的活体分子成像方法,通过示踪表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针,可对组织、器官的病变进行分子水平的探测与成像,从而实现疾病的早期诊断和实时监控。氟 18(18F)因其具有适宜成像的核素性质而被广泛用于PEI探针的标记。《随着PET的广泛应用低兔疫原性和高亲和力的多肽作为PEr探针的靶向分子受到关注但由于多肽对高温、强酸强碱、有机溶剂等标记条件相对较敏感,多肽的1F标记仍面临巨大挑战,与此同时新型标记方法也层出不穷。本综述根据多肽的18F标记过程的复杂程度,即一步标记法、多步标记法和固相标记法,分别举例阐述了F标记多肽代表性研究进展,并讨论了不同标记方法的特点为标记多肽的合成、基础研究和临床研究提供孓参考关键词:氟-18:18F标记方法;多肽;正电子发射探针中图分类号:TL92+3 文献标志码:A 分子影像技术能反映机体组织x细胞及分子水平的代谢和功能状态的变化,不仅是疾病早期诊断的利器,可为个体化治疗提供指导,在新药研发领域也有着巨大的应用前景2。其中, 正电子发射断层成像 positron emission tomography,PET通过正电子发射分子探针对体内组织器官微观病变进行分水平的探测与成像,具有高灵敏度、无创、高穿透深度等优势,已广泛用于肿瘤、神经系统及心血管系统等疾病的诊断和硏究。表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针是PET成像的基础,通常由正电子发射核素和高亲和性的配体组成。在能够发射正电子的放射性核素中,18F具有优良的核素性质适用于医学成像,如:1)较低的最大正电子能量(635keV)使得正电子湮没前在组织中穿行距离较短,从而提供较高分辨率的图像H5:2)半衰期(1098min)适中,可避免受试者长时间内照射,但仍满足标记化学、体内显像和远程配送需求,广泛用于PEI探针的合成冏多肽作为靶向特定受体的优良配体具有多种优势而受到了广泛的关注:1)特异性高、组织穿透能力强;2)低分子量有利于多肽从血液和非靶组织中被快速清除,使得显像有较高的靶与收稿日期:2020-05-12录用日期:2020-07-03 基金项目:国家自然科学基金(81971674);福建省自然科学基金(2019106006 通信作者:zijing.Iic@xmu.edu.cn

收稿日期：2020-05-12 录用日期：2020-07-03 基金项目：国家自然科学基金（81971674）；福建省自然科学基金（2019J06006） *通信作者：zijing.li@xmu.edu.cn doi: 10.6043/j.issn.0438-0479.202005009 ·综述· 多肽 18F 标记方法研究进展杨鸿章，牟钊彪，李子婧* （厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心，福建厦门 361102）摘要：正电子发射断层成像（positron emission tomography，PET）是高灵敏、可定量及无创的活体分子成像方法，通过示踪表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针，可对组织、器官的病变进行分子水平的探测与成像，从而实现疾病的早期诊断和实时监控。氟 -18( 18F)因其具有适宜成像的核素性质而被广泛用于 PET 探针的标记。随着 PET 的广泛应用，低免疫原性和高亲和力的多肽作为 PET 探针的靶向分子受到关注，但由于多肽对高温、强酸、强碱、有机溶剂等标记条件相对较敏感，多肽的 18F 标记仍面临巨大挑战，与此同时新型标记方法也层出不穷。本综述根据多肽的 18F 标记过程的复杂程度，即一步标记法、多步标记法和固相标记法，分别举例阐述了 18F 标记多肽代表性研究进展，并讨论了不同标记方法的特点，为 18F 标记多肽的合成、基础研究和临床研究提供了参考。关键词：氟-18；18F标记方法；多肽；正电子发射探针中图分类号：TL 92+3 文献标志码：A 分子影像技术能反映机体组织、细胞及分子水平的代谢和功能状态的变化，不仅是疾病早期诊断的利器，可为个体化治疗提供指导，在新药研发领域也有着巨大的应用前景[1-2]。其中，正电子发射断层成像(positron emission tomography，PET)通过正电子发射分子探针对体内组织器官微观病变进行分子水平的探测与成像，具有高灵敏度、无创、高穿透深度等优势，已广泛用于肿瘤、神经系统及心血管系统等疾病的诊断和研究。表征特定生理功能或靶向病理标志物的正电子发射分子探针是 PET 成像的基础，通常由正电子发射核素和高亲和性的配体组成[3]。在能够发射正电子的放射性核素中，18F 具有优良的核素性质适用于医学成像，如：1）较低的最大正电子能量(635 keV)使得正电子湮没前在组织中穿行距离较短，从而提供较高分辨率的图像[4-5]；2）半衰期(109.8 min)适中，可避免受试者长时间内照射，但仍满足标记化学、体内显像和远程配送需求，广泛用于 PET 探针的合成[6]。多肽作为靶向特定受体的优良配体具有多种优势而受到了广泛的关注：1）特异性高、组织穿透能力强；2）低分子量有利于多肽从血液和非靶组织中被快速清除，使得显像有较高的靶与厦门大学学报（自然科学版）

非靶比值;3)由于生物同源性,多肽一般不具有免疫原性,安全性较高。因此,如何用放射性核素标记种类繁多的多肽进而制备出多肽探针,逐渐成为了疾病精准诊断和个性化治疗领域的研究热点。目前,放射性标记多肽主要通过mrc、6Ga和1mLu等放射性金属标记,但是螯合基团相对庞大可能影响多肽的靶向性,不适用于多肽放射性标记80。在过去的几年间,报道了许多的新型1F标记多肽的方法,并在温和标记方面有重要发展。根据标记过程的复杂程度可以系统地分为一步标记法、多步标记法和固相标记法。本文将分别对这些标记方法进行综 1一步18F标记多肽策略 11基于生成C-18F键的一步标记方法基于CF键生成的一步F标记法按机理可分为亲电取代反应、亲核取代反应和自由基反应。其中,基于CF键的1F亲电取代、亲核取代反应已被广泛地应用于小分子的标记,但它们的标记条件往往较为苛刻,且多肽对高温、有机溶剂、强酸等反应条件较为敏感,因此基于 C-SF键生成的一步标记多肽方法的报道相对较少。而近年来开发的基于C-1F键生成的自由基反应,标记条件较为温和、区域选择性好,应用前景阔 111基于芳香环亲电反应的一步18F标记多肽方法在2003年, Ogawa等利用氟乙酰亲电取代的方式,在水相室温条件下成功实现了 c(RGDfMev的一步法标记(图1)该标记方法对多肽结构改变较小,因此多肽活性的影响较小,但反应需要在三氟乙酸溶液中进行,不适合pH敏感的多肽的1F标记。此外,该反应的化学选择性较差,在没有定位基团的情况下可出现多个标记产物,且比活度较低(328×10 GBq/umo),不适用于对比活度要求较高的受体显像 (i)[]AcOF,三氟乙酸,乙腈,室温。图1基于芳香环亲电反应的一步18F标记多肽方法 Fig. I One-step F-labeling of peptides based on aromatic ring electrophilic reaction

非靶比值；3）由于生物同源性，多肽一般不具有免疫原性，安全性较高[7]。因此，如何用放射性核素标记种类繁多的多肽进而制备出多肽探针，逐渐成为了疾病精准诊断和个性化治疗领域的研究热点。目前，放射性标记多肽主要通过 99mTc、68Ga 和 177Lu 等放射性金属标记，但是螯合基团相对庞大可能影响多肽的靶向性，不适用于多肽放射性标记[8-10]。在过去的几年间，报道了许多的新型 18F 标记多肽的方法，并在温和标记方面有重要发展。根据标记过程的复杂程度可以系统地分为一步标记法、多步标记法和固相标记法。本文将分别对这些标记方法进行综述。 1 一步 18F 标记多肽策略 1.1 基于生成 C- 18F 键的一步标记方法基于 C- 18F 键生成的一步 18F 标记法按机理可分为亲电取代反应、亲核取代反应和自由基反应。其中，基于 C-F 键的 18F 亲电取代、亲核取代反应已被广泛地应用于小分子的标记，但它们的标记条件往往较为苛刻，且多肽对高温、有机溶剂、强酸等反应条件较为敏感，因此基于 C- 18F 键生成的一步标记多肽方法的报道相对较少。而近年来开发的基于 C- 18F 键生成的自由基反应，标记条件较为温和、区域选择性好，应用前景广阔。 1.1.1 基于芳香环亲电反应的一步 18F 标记多肽方法在 2003 年，Ogawa 等[11]利用氟乙酰亲电取代的方式，在水相室温条件下成功实现了 c(RGDfMeV)的一步法 18F 标记（图 1）。该标记方法对多肽结构改变较小，因此多肽活性的影响较小，但反应需要在三氟乙酸溶液中进行，不适合 pH 敏感的多肽的 18F 标记。此外，该反应的化学选择性较差，在没有定位基团的情况下可出现多个标记产物，且比活度较低(3.28 × 10-2 GBq/μmol)，不适用于对比活度要求较高的受体显像。 (i) [ 18F]AcOF，三氟乙酸，乙腈，室温。图 1 基于芳香环亲电反应的一步 18F 标记多肽方法 Fig. 1 One-step 18F-labeling of peptides based on aromatic ring electrophilic reaction 厦门大学学报（自然科学版）

1.1.2 基于亲核反应的一步 18F 标记多肽方法 [ 18F]F-的芳香亲核取代(SNAr)是直接形成 C(sp2 )- 18F 键常用标记方法，前体通常包含离去基团，并在离去基团的对位或邻位带有活化基团（通常为强吸电子基团）。Becaud 等[12]报道了以三甲基铵作为离去基团，用DMSO为反应溶剂在50 ℃下反应15 min，通过[ 18F]F-亲核取代反应实现多肽的一步 18F 标记（图 2a），经 radio-HPLC 测定放射化学产率(RCY)为 19%~92%。 Jacobson等[13]通过4-硝基-3-三氟甲基苯甲酰氯与c(RGDfK)和二聚RGD肽E[c(RGDfK)]2偶联，利用微波反应在 DMSO 溶剂中 130 ℃下加热反应 3.5 min，实现了以硝基为离去基团多肽的一步 18F 标记（图 2b），其 RCYs 为 7%~23%。基于亲核反应的一步 18F 标记往往需要在无水、高温和有机溶剂等苛刻的条件下进行，因此不适用于敏感多肽的标记。 (i) [ 18F]KF，DMSO，50 ℃，15 min；(ii) [ 18F]KF，DMSO，130 ℃，3.5 min。图 2 基于亲核反应的一步 18F 标记多肽方法 Fig. 2 One-step 18F-labeling of peptides based on nucleophilic reaction 1.1.3 基于自由基反应的一步 18F 标记多肽方法 2018 年 Britton 等[14]报道了在紫外光(365 nm)照射下，以十聚钨酸钠(NaDT)为催化剂、[ 18F]N- 氟苯磺酰亚胺([18F]NFSI)为放射性氟源进行含亮氨酸多肽的 18F 标记（图 3），其 RCYs 为 16%~35%。由于亮氨酸残基中的异丙基在光照及催化条件下倾向于生成稳定的三级碳自由基，在链转移过程中结合[ 18F]NFSI 中的 18F 得到标记产物。该方法标记可以耐受水相介质，反应条件较为温和、区域选择性好，其多肽中氨基、羧基等活性基团不需要提前保护，不需要借助标记辅助基团，对多肽结构改变较小。但这种标记方法只适用于含有亮氨酸结构的多肽，且反应时间相对较长，比活度较低（1.3 ×10-3 ~5.3 ×10-3 GBq/μmol），不适用于对比活度要求较高的厦门大学学报（自然科学版）

受体显像。 (i) [ 18F]NFSI，NaDT，乙腈，水，室温，40 min。图 3 基于自由基反应的一步 18F 标记多肽 Fig. 3 One-step 18F-labeling of peptides based on free radical reaction 1.2 基于生成 Si- 18F 键的一步标记方法与 C-F 键的键能(480 kJ/mol)相比，Si-F 键具有更高的键能(> 570 kJ/mol)，更稳定，于是基于生成 Si- 18F 键的标记方法引起了研究人员的广泛关注。1985 年，Rosenthal 等[15]首次将 Si- 18F 键引入到标记化学中，在乙腈水溶液（V 乙腈:V 水 = 13:7）中，[ 18F]四甲基氟化铵与三甲基氯硅烷反应得到[ 18F]三甲基氟硅烷，经过衰减校正后产率为 80%。大鼠吸入[ 18F]三甲基氟硅烷后，骨骼中有明显的氟离子富集，表明[ 18F]三甲基氟硅烷在体内稳定性较差。但是该研究首次证明了在含水介质亦可形成 Si- 18F 键，打开了温和 18F 标记的大门。之后，Höhne 等[16,17]通过密度泛函理论建立了有机氟硅烷水解的理论模型，发现通过增加围绕硅原子的空间位阻能提高 Si- 18F 键的稳定性。以 DMSO 为反应溶剂，在 30~90 ℃条件下，羟基或氢为离去基团经[ 18F]F -亲核取代反应合成了含有双功能官能团 18F 标记的有机氟硅烷，RCYs 为 25%~90%，并将其进一步与蛙皮素肽偶联实现了多肽的 18F 标记。通过该法标记的多肽在体内外均有较好的稳定性，首次实现了基于生成 Si- 18F 键的多肽 18F 标记，但该方法通过两步实现多肽的 18F 标记，且标记条件相对苛刻。Schirrmacher 等[18]以叔丁基大位阻保护的叔丁基氟硅烷(SiFA)和奥曲肽通过肟键相连形成 “SiFA-多肽”作为标记前体，通过 19F/ 18F 同位素交换法在无水乙腈中室温下反应 15 min 实现了 SiFA-多肽的一步 18F 标记（图 4），RCYs 为 95%~97%。但当乙腈水溶液（V 乙腈:V 水 = 1:4）作为反应溶剂，该反应在室温下 RCYs 仅为 5%，而在 95 ℃下 RCYs 高达 70%~90%。该标记方法需要过量的标记前体才能获得较高的 RCYs，而标记产物无法通过化学方法与前体分离，因此比活度较低。厦门大学学报（自然科学版）

最佳的p值约为40左右。[F]A2NOTA多肽与[F]AF2NODA-多肽的合成大致相同, 但在相同条件下[F]AF2+NODA多肽的产率更高。2012年 Mcbride等P实现了NODA甲基苯基乙酸(MPAA}dHSG(组胺-琥珀酰-甘氨酸)半抗原肽的标记试剂盒化,以乙醇/生理盐水(1/1) 为溶剂,在108℃下反应15mn后用 Alumina n柱纯化,标记产物的RCYs为45.6% 基于生成A-8F键的一步标记多肽方法取得了较大的进展,并逐渐试剂盒化,广泛地用多肽的F标记。美中不足的是,铝螯合步骤需要在高温条件下(100℃)进行,不利于对温度敏感的多肽的标记。 Cleeren等凹报道了() H3RESCA作为[F]AF2+的新型螯合基团,通过适当减小螯合基团的结构刚性优化了[FAF2与配体螯合的标记条件,在室温下35min内实现了人血清白蛋白、NbV4m119、 nanobody等生物分子的1F一步标记和纯化,且获得了较满意的 RCY(35%-63%) 15基于PBF键的一步标记法 PF的键能(490k/m)与CF键键能相近,因此PF键在体内外可能具有较好的稳定性。此外,氟化碳、氟化硼、氟化硅、氟化磷的自由基生成热分别为255.0±84、-115.8±13.8、-20.1 ±125、-52.3±209 kJ/mol,说明磷氟化物、硅氟化物、)硼氟化物会比碳氟化物更容易形成 Studenov等首次利用磷酰氯和F在室温条件下通过亲核取代反应将PF键引入到F标记化学中,反应5mn后,其RCYs可达96%图%(a))。但是该化合物在体外的稳定性较差在水溶液中30min便出现明显分解(脱氟)。Vabe等凹以 NHC-PF5为标记前体,在路易斯酸 SnCl4催化的条件下通过1FF同位素交换法与[FF在60℃反应10min,成功标记了 FINHC-PF5(图9b),但RCYs较低,仅为4%6%。虽然[ FJNHC-PFs在体内外具有较好的稳定性,但该标记方法的RCYs太低,不适用于临床应用。在2019年,Hong等设计了以氟代氧化膦( DBPOF)作为氟受体的lF标记方法,通过大位阻保护策略提高PF键在体内外的稳定性。将 DBPOE与生物分子例如c(RGDk)和HSA偶联后,首次在室温、中性纯水相的条件下通过1F/F同位素交换法实现了一步、温和F标记多肽(图9(c),RCYs高达(50±5)% 该标记方法解决了对溶剂、温度、pH敏感的多肽、蛋白的一步1F标记方法。但由于标记采取同位素交换法,其比活度较低(0.22-0.37GBqμmo),往往需要使用较高活度的[FF才能获得满足受体成像要求的比活度(37GBq/μmol)

最佳的 pH 值约为 4.0 左右。[ 18F]AlF2+ -NOTA-多肽与[ 18F]AlF2+ -NODA-多肽的合成大致相同，但在相同条件下[ 18F]AlF2+ -NODA-多肽的产率更高。2012 年 Mcbride 等[23]实现了 NODA-甲基苯基乙酸(MPAA)-di-HSG（组胺-琥珀酰-甘氨酸）半抗原肽的标记试剂盒化，以乙醇/生理盐水(1/1) 为溶剂，在 108 ℃下反应 15 min 后用 Alumina N 柱纯化，标记产物的 RCYs 为 45.6%。基于生成 Al- 18F 键的一步标记多肽方法取得了较大的进展，并逐渐试剂盒化，广泛地用于多肽的 18F 标记。美中不足的是，铝螯合步骤需要在高温条件下(100 ℃)进行，不利于对温度敏感的多肽的标记。Cleeren 等[24]报道了(±)H3RESCA 作为[ 18F]AlF2+的新型螯合基团，通过适当减小螯合基团的结构刚性优化了[ 18F]AlF2+与配体螯合的标记条件，在室温下 35 min 内实现了人血清白蛋白、NbV4m119、nanobody 等生物分子的 18F 一步标记和纯化，且获得了较满意的 RCYs(35%~63%)。 1.5 基于 P- 18F 键的一步标记法 P-F 的键能(490 kJ/mol)与 C-F 键键能相近，因此 P-F 键在体内外可能具有较好的稳定性。此外，氟化碳、氟化硼、氟化硅、氟化磷的自由基生成热分别为 255.0 ± 8.4、-115.8 ± 13.8、-20.1 ± 12.5、-52.3 ± 20.9 kJ/mol，说明磷氟化物、硅氟化物、硼氟化物会比碳氟化物更容易形成。 Studenov 等[25]首次利用磷酰氯和[ 18F]F-在室温条件下通过亲核取代反应将 P- 18F 键引入到 18F 标记化学中，反应 5 min 后，其 RCYs 可达 96%（图 9(a)）。但是该化合物在体外的稳定性较差，在水溶液中 30 min 便出现明显分解（脱氟）。Vabre 等[26]以 NHC-PF5 为标记前体，在路易斯酸 SnCl4 催化的条件下通过 18F/19F 同位素交换法与[ 18F]F-在 60 ℃反应 10 min，成功标记了 [ 18F]NHC-PF5（图 9(b)），但 RCYs 较低，仅为 4%~6%。虽然[ 18F]NHC-PF5 在体内外具有较好的稳定性，但该标记方法的 RCYs 太低，不适用于临床应用。在 2019 年，Hong 等[27]设计了以氟代氧化膦(DBPOF)作为氟受体的 18F 标记方法，通过大位阻保护策略提高 P-F 键在体内外的稳定性。将 DBPOF 与生物分子例如 c(RGDyk)和 HSA 偶联后，首次在室温、中性纯水相的条件下通过 18F/19F 同位素交换法实现了一步、温和 18F 标记多肽（图 9(c)），RCYs 高达(50±5)%。该标记方法解决了对溶剂、温度、pH 敏感的多肽、蛋白的一步 18F 标记方法。但由于标记采取同位素交换法，其比活度较低(0.22~0.37 GBq/μmol)，往往需要使用较高活度的[ 18F]F-才能获得满足受体成像要求的比活度(37 GBq/μmol)。厦门大学学报（自然科学版）

图 10 活化羧基 18F 标记辅基结构 Fig. 10 18F-labeled activated esters Haubner 等 [30] 利用 [ 18F]NFP 以 DMSO 为反应溶剂在 70 ℃ 下与环 (-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(SAA)-)反应 15 min，实现了多肽与[ 18F]NFP 偶联，RCYs 约为 50%。与[ 18F]NFP 相比，辅基[ 18F]SFB 的特征是芳香族[ 18F]氟苯甲酰基残基，[ 18F]SFB 优先与肽主链中存在的伯胺偶联。Vaidyanathan 和 Zalutsky[31]于 1992 年首次报道了[ 18F]SFB 的合成，即以三甲酸酯 4-甲酰基-N，N，N-三甲基苯胺为标记前体进行 18F 标记，然后氧化形成 4-[ 18F]氟苯甲酸，随后在缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)存在条件下与 N-羟基琥珀酰亚胺反应生成[ 18F]SFB，总合成时间为 100 min，RCYs 约为 25%。Thonon 等[32]通过[ 18F]SFB 实现了 PEG-E[c(RGDyK)]2 的自动化合成，总合成时间约为130 min，RCYs为(13 ± 3)% (n ＝ 13)，经纯化后放射化学纯度> 98%，比活度为(140±40) GBq/μmol。Kapty 等[33]利用[ 18F]SFB 以混合溶液(V 乙腈 : V 柯耳蜀夫缓冲液=1 : 3，pH = 8.4)为反应液在 40 ℃的条件下反应 40 min，实现[ 18F]SFB 与 LIKKPF 多肽的偶联，RCYs 约为 75%。酰化剂[ 18F]SFB 是目前最重要和常用的 18F 标记肽的标记辅助基团。 Basuli 等[34]通过 N，N，N-三甲基-5-（（（2,3,5,6-四氟苯氧基）羰基）吡啶-2-铵三氟甲磺酸盐的[ 18F]TBAF 亲核取代，在 40 ℃下搅拌 10 min 获得[ 18F]F-Py-TFP，RCYs 为(50 ± 10)%。以磷酸盐缓冲液(pH = 9.0)为反应溶剂，在 40 ℃下反应 15 min 实现[ 18F]F-Py-TFP 与 HSA 偶联，此条件下 RCYs 高达 97%。基于羧基活化酯标记辅助基团的多步 18F 标记多肽的反应条件比较温和，偶联过程可在水相室温条件下进行，但反应步骤过多且总放射化学产率较低。近年来，随着标记辅助基团总放射化学产率的明显提高和多肽标记步骤的逐渐简化，该方法有望广泛应用于多肽温和标记。 2.2 基于醛基辅助基团的多步标记方法由于醛基与氨氧基和联氨基具有较高的反应活性，因此含醛基的标记辅助基团可用于氨氧厦门大学学报（自然科学版）