问题系列2 完成时间：2月18日2月23日 l.细菌在铁缺乏环境中生长时，会产生一种螯铁蛋白pyochelin(见图1)，它是一种的铁离 子鳌合剂。绿脓杆菌P.aeruginosa的基因组测序显示有两个基因簇一pchEF和pchDCBA与 鳌铁蛋白的生物合成有关。图2显示了PchD,PchE和PchF的结构域排列方式。三种蛋白 产物PchD、PchE、PchF已通过组氨酸标记方法被提纯（见图3）。 图l.pyochelin ● CO2H CO,H salicylate cysteine,SAM,ATP pyochelin 图2.PchD,E,F基因的结构域编码排列 A ArCP Cyc1 A1 PCP1 Cyc2 A2 PCP2 TE PchD PchE PchF M=甲基转移酶 E=差向异构酶 图3.（略）
问题系列 2 完成时间: 2 月 18 日~2 月 23 日 1．细菌在铁缺乏环境中生长时，会产生一种螯铁蛋白 pyochelin（见图 1），它是一种的铁离 子螯合剂。绿脓杆菌 P.aeruginosa 的基因组测序显示有两个基因簇―pchEF 和 pchDCBA 与 螯铁蛋白的生物合成有关。图 2 显示了 PchD，PchE 和 PchF 的结构域排列方式。三种蛋白 产物 PchD、PchE、PchF 已通过组氨酸标记方法被提纯（见图 3）。 图 1. pyochelin 图 2. PchD, E, F 基因的结构域编码排列 M = 甲基转移酶 E = 差向异构酶 图 3. (略)
对该系统己获得如下信息： a.将从E.coli中提取的这三种蛋白质与水杨酸、半胱氨酸、ATP和S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 一起温育后，没有得到预想的产物(pyochelin)。 b.用[田-CoA和Sfp(泛酰巯基乙胺磷酸转移酶)与PchE和PchF温育，可以获得放射性 标记的PchE和PchF,用此标记的蛋白重复上述实验(a),则可用HPLC(高效液相层析) 分离获得pyochelin(有标准品作对照)。 c.将半胱氨酸、ATP和[Y-32P]标记的无机磷焦磷酸与PchE或PchF共同温育，均可使2p 掺入到ATP分子中。（见图4B和4C) d.加入水杨酸后，再重复上述实验(c),则发现PchE和PchF都不能使ATP被P标记： 但用PchD做同样的实验，则可获得P标记的ATP。(见图4D) e.作另外一个试验，分别将PchE、PchF和PchD与4C]水杨酸、半胱氨酸和ATP温育， 然后检测不同蛋白(PchE,PchF)对标记物去路的影响。（图5） (图略) 图4.YP-PP掺入ATP生成P-ATP的效率（描述见上）
对该系统已获得如下信息： a．将从 E.coli 中提取的这三种蛋白质与水杨酸、半胱氨酸、ATP 和 S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 一起温育后，没有得到预想的产物（pyochelin）。 b．用[ 3 H]-CoA和Sfp（泛酰巯基乙胺磷酸转移酶）与PchE和PchF温育，可以获得放射性 标记的PchE和PchF，用此标记的蛋白重复上述实验（a），则可用HPLC(高效液相层析) 分离获得pyochelin（有标准品作对照）。 c．将半胱氨酸、ATP和[γ- 32P]标记的无机磷焦磷酸与PchE或PchF共同温育，均可使32P 掺入到ATP分子中。（见图 4B和 4C） d．加入水杨酸后，再重复上述实验（c），则发现PchE和PchF都不能使ATP被32P标记； 但用PchD做同样的实验，则可获得32P标记的ATP。（见图 4D） e．作另外一个试验，分别将PchE、PchF和PchD与[ 14C]水杨酸、半胱氨酸和ATP温育， 然后检测不同蛋白（PchE，PchF）对标记物去路的影响。（图 5） （图略） 图 4.[γ]-32P-PPi掺入ATP生成[ 32P]-ATP的效率（描述见上）
图5.（略） 问题： i. 根据已学有关NRPS的知识和上面给出的信息，推测pyochelin的生物合成途径。 ii.对实验()和(b)的数据结果进行解释，解释应与第一题的回答一致。 ii.阐明ATP在pyochelin生物合成中的作用，并解释图4BD中的数据怎么支持这一 作用。 ⅳ.试讨论图5中的数据能否进一步支持你在第一题中提出的机制。 V.推测S-腺苷甲硫氨酸的作用。 2.利福霉素是一种用于治疗结核病的抗生素。参与利富霉素合成的酶由一个多功能五蛋白 核心构成，包括RfA、B、C、D、E和F。RifA是N-末端的蛋白成分。克隆表达出带有His)6 标记的RifA,并将其纯化，用基因重组方法将RfA的C-端带上TE结构域。将His)6-RfA 与3-氨基-5-羟基苯甲酸、丙二酰CoA(McoA)、甲基丙二酰CoA(MMCoA)共同温育，则反 生以下反应，生成产物I。(Eq1)
图 5. (略) 问题： i． 根据已学有关 NRPS 的知识和上面给出的信息，推测 pyochelin 的生物合成途径。 ii． 对实验(a)和(b)的数据结果进行解释，解释应与第一题的回答一致。 iii． 阐明 ATP 在 pyochelin 生物合成中的作用，并解释图 4B~D 中的数据怎么支持这一 作用。 iv． 试讨论图 5 中的数据能否进一步支持你在第一题中提出的机制。 v． 推测 S-腺苷甲硫氨酸的作用。 2．利福霉素是一种用于治疗结核病的抗生素。参与利富霉素合成的酶由一个多功能五蛋白 核心构成，包括 RifA、B、C、D、E 和 F。RifA 是 N-末端的蛋白成分。克隆表达出带有(His)6- 标记的 RifA，并将其纯化，用基因重组方法将 RifA 的 C-端带上 TE 结构域。将(His)6-RifA 与 3-氨基-5-羟基苯甲酸、丙二酰 CoA(McoA)、甲基丙二酰 CoA(MMCoA)共同温育，则反 生以下反应，生成产物 I。（Eq.1）
C02 HO MCoA+MMCoA H>N OH (His)6-RifA 3-amino-5-hydroxybenzoate 反应1(Eq.1) i. 己知PKS和NRPS作用机制的基本规律，RifA作为一种N-端组件蛋白，其催化的 生物合成途径的顺序会是怎样的呢？ ii. PKS和NRPS组件中的翻译后修饰对其催化活性非常重要，如合成利福霉素等天然 产物。指出RA的结构域和它怎样修饰（写出修饰的化学反应）才能活化从面催化 产物I的生成。 ⅱ.作为I的前体，3-氨基-5羟基苯甲酸的活化需哪些化学改变？ iv.(参照Keating&Walsh文章中的方式，)画出合成所需的RifA组件的结构域及其顺 序。[注意，你们可能会发现在回答完第ⅴ题后再做此题会变得更容易。] V.推测反应1(Eq.1)的具体合成途径，即从起始底物怎样转变为终产物I,如果认为需 要，可添加ATP或氧化还原辅因子。 附加问题：（认识生物合成的复杂性，这将比你们想象的要难得多。） 曲霉菌是一种能产生洛伐他汀lovastatin)的真菌，洛伐他汀是HMG-CoA还原酶（胆固醇合 成的限速酶)的抑制剂。这种降胆固醇药物及同类产品每年为药厂提供几十亿美元的收益。 它的合成需有三个基因(lovb,lovc和love)。lovb又称LNKS,它是一个累接壬酮（九碳酮） 合成酶，它包含合成二氢洛伐他汀L(合成洛伐他汀的中间产物)的所有结构域信息。 HO C02 OH LNKS,lovb KS AT/MAT DH MeT KR ACP X Lovastatin
反应 1 (Eq.1) i． 已知 PKS 和 NRPS 作用机制的基本规律，RifA 作为一种 N-端组件蛋白，其催化的 生物合成途径的顺序会是怎样的呢？ ii． PKS 和 NRPS 组件中的翻译后修饰对其催化活性非常重要，如合成利福霉素等天然 产物。指出 RifA 的结构域和它怎样修饰（写出修饰的化学反应）才能活化从面催化 产物 I 的生成。 iii． 作为 I 的前体，3-氨基-5 羟基苯甲酸的活化需哪些化学改变？ iv． （参照 Keating & Walsh 文章中的方式，）画出合成所需的 RifA 组件的结构域及其顺 序。[注意，你们可能会发现在回答完第 v 题后再做此题会变得更容易。] v． 推测反应 1(Eq.1)的具体合成途径，即从起始底物怎样转变为终产物 I，如果认为需 要，可添加 ATP 或氧化还原辅因子。 附加问题：（认识生物合成的复杂性，这将比你们想象的要难得多。） 曲霉菌是一种能产生洛伐他汀(lovastatin)的真菌，洛伐他汀是 HMG-CoA 还原酶（胆固醇合 成的限速酶）的抑制剂。这种降胆固醇药物及同类产品每年为药厂提供几十亿美元的收益。 它的合成需有三个基因（lovb, lovc 和 love）。lovb 又称 LNKS，它是一个累接壬酮（九碳酮） 合成酶，它包含合成二氢洛伐他汀 L（合成洛伐他汀的中间产物）的所有结构域信息
HO C02 OH 1 CH COSCoA +1 SAM +8 MCoA H dihydromonacolin L 此途径中有很多特殊之处，其中之一就是环化需要Diels Alder反应，如果这种推测是正确 的，那么它将是此种反应的第一个例子。 另一个特殊之处是：在洛伐他汀合成的全过程中，IOvB并没有ER结构域，而它的ER结构 域是由另外两个基因的产物的其中之一提供的。如果只表达1ob,则可产生几个产物，其中 之一见下图（Ⅱ）。 如果三个基因一起表达，就能合成洛伐他汀及中间产物I。 利用Diels Alder反应和ER结构域可由其它蛋白提供的事实，推测从起始底物到中间产物I 的合成过程
此途径中有很多特殊之处，其中之一就是环化需要 Diels Alder 反应，如果这种推测是正确 的，那么它将是此种反应的第一个例子。 另一个特殊之处是：在洛伐他汀合成的全过程中，lovB 并没有 ER 结构域，而它的 ER 结构 域是由另外两个基因的产物的其中之一提供的。如果只表达 lovb，则可产生几个产物，其中 之一见下图（II）。 如果三个基因一起表达，就能合成洛伐他汀及中间产物 I。 利用 Diels Alder 反应和 ER 结构域可由其它蛋白提供的事实，推测从起始底物到中间产物 I 的合成过程