《饲料工业》·2005年第26卷第10期 专家论坛 对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 谭北平 气气气气气 ⊥气"气气气 我国饲料工业起步于20世纪70年代,至2004认为最有效的战略是对人和食用动物合理使用和尽 年,我国饲料年产量已超过8500万吨。但随着我国可能少使用抗菌素。免疫增强剂是无害、无污染的绿 养殖业集约化程度的提高和饲料工业的发展,抗生色环保产品,在水产养殖中的应用前景是诱人的。从 素、化学合成药和类固醇激素,如促长素、驱虫剂、激食品的安全性、人类的健康和环境保护的角度来讲, 素、调味剂、改良剂、色素剂、防腐剂等饲料添加剂也免疫增强剂作为水产饲料添加剂符合可持续发展的 随之普遍使用 要求,是饲料业发展的必然方向。本课题的总体目标 抗生素作为饲料添加剂使用已有50年的历史,是研究开发先进、稳定的对虾和贝类非特异性免疫增 为动物的生长和健康作出了巨大贡献,是目前饲料中强剂,研究产品的应用技术,并实现产业化生产。 用量最大、最广的添加剂之一。自1975年日本最早报1课题取得的主要成果 道病原菌抗药性现象以来,人们发现,由于大量和滥对虾和贝类非特异性兔疫增强剂的研制与应用 用抗生素已给动物本身、动物产品和环境带来一系列是国家高技术研究发展计划(863计划)海洋生物技术 的问题。主要表现在,动物病原菌产生抗药性,导致抗主题在“十五”期间设立的唯一一项关于水产饲料添 生素用量的增加,引起内源性感染和二重感染。特别加剂的课题。该课题研究了免疫增强剂作为饲料添加 是长期使用会造成消化道内本身微生态失调和环境剂在对虾、鲍鱼全周期养殖期间以及作为药物浸浴剂 的污染。同时抗生素在产品中的残留还直接影响人类在对虾、扇贝、鲍鱼育苗期的应用技术,重点解决了最 的免疫和健康。水产品食用安全问题越来越受到人们佳使用时机、持续时间以及使用剂量等。 的普遍关注 1.1建立了完善的免疫指标体系 欧盟对于中国出口动物产品的药物残留及安全 通过对来自未发病虾池、发病虾池和曾发病虾池 生产体系提出了更高、更具体的要求,直接影响了我大量对虾样品的多项免疫指标及感染白斑综合症病 国动物产品对欧盟市场的出口。俄罗斯、日本等也纷毒状况的综合分析和测定,进行了白斑综合症病毒 纷限制我国动物产品的出口,使得我国近年来动物产(WSsⅥ感染与对虾的相关免疫因子的相关性研究(见 品的出口急骤下降。香港发生的禽流感以及某些大陆图1)。研究结果证实:WSSV感染与对虾血淋巴酚氧 供港猪中检出β-兴奋剂(B- agonist)等也极大地影响化酶活性和碱性磷酸酶相对活性密切相关,如果对虾 了大陆畜禽的供港配额,使我国政治形象和经济利益机体的酚氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较高水平时 受到严重损失。 对虾即使已感染了病毒也不会发病,但对虾机体的酚 我国是水产养殖大国,然而水产品出口创汇率却氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较低水平时,潜伏感染 与我们的产量远不相符。加入wTO以后,我们将拿什的对虾可引发病毒的迅速增殖,乃至发病;发病虾的 么样的产品来参与国际竞争?我们如何应对欧盟、美各项免疫指标其平均值低于未发病虾;对虾感染病毒 国、日本等国际市场越来越严格的技术壁垒?很显然,可引发机体过氧化物酶活性显著降低。此外,酸性磷 水产养殖中过分依赖抗菌素的局面必须从根本上改酸酶活性、血淋巴吞噬活性、血细胞密度等指标也与 变,绿色环保型添加剂的研究与应用应受到重视 对虾病毒感染关系密切。 如何对待因使用抗生素产生的负面效应,WHO 因此,以对虾病毒感染与机体免疫的相关关系为 基础,在国际上首次正式确认对虾病毒感染与机体免 ★国家高技术研究发展计划863计划课题成果2001A622疫密切相关的免疫指标(5个)—酚氧化酶活性、碱 060和2003AA622060) 性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性、血细胞密度、淋巴细 谭北平,中国海洋大学,教授,博士生导师,266003,青岛。胞吞噬活性,作为多糖类免疫增强剂筛选的敏感指 皮稿日期:2005-03-16 标,这为筛选出高效稳定的免疫增强剂奠定了理论基 o1994-2007chinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
我国饲料工业起步于 !" 世纪 #" 年代! 至 !""$ 年!我国饲料年产量已超过 % &"" 万吨" 但随着我国 养殖业集约化程度的提高和饲料工业的发展! 抗生 素#化学合成药和类固醇激素!如促长素#驱虫剂#激 素#调味剂#改良剂#色素剂#防腐剂等饲料添加剂也 随之普遍使用" 抗生素作为饲料添加剂使用已有 &" 年的历史! 为动物的生长和健康作出了巨大贡献!是目前饲料中 用量最大#最广的添加剂之一" 自 ’(#& 年日本最早报 道病原菌抗药性现象以来!人们发现!由于大量和滥 用抗生素已给动物本身#动物产品和环境带来一系列 的问题" 主要表现在!动物病原菌产生抗药性!导致抗 生素用量的增加!引起内源性感染和二重感染" 特别 是长期使用会造成消化道内本身微生态失调和环境 的污染" 同时抗生素在产品中的残留还直接影响人类 的免疫和健康" 水产品食用安全问题越来越受到人们 的普遍关注" 欧盟对于中国出口动物产品的药物残留及安全 生产体系提出了更高#更具体的要求!直接影响了我 国动物产品对欧盟市场的出口" 俄罗斯#日本等也纷 纷限制我国动物产品的出口!使得我国近年来动物产 品的出口急骤下降" 香港发生的禽流感以及某些大陆 供港猪中检出 !)兴奋剂$!)*+,-./0%等也极大地影响 了大陆畜禽的供港配额!使我国政治形象和经济利益 受到严重损失" 我国是水产养殖大国!然而水产品出口创汇率却 与我们的产量远不相符" 加入 123 以后!我们将拿什 么样的产品来参与国际竞争& 我们如何应对欧盟#美 国#日本等国际市场越来越严格的技术壁垒& 很显然! 水产养殖中过分依赖抗菌素的局面必须从根本上改 变!绿色环保型添加剂的研究与应用应受到重视" 如何对待因使用抗生素产生的负面效应!143 认为最有效的战略是对人和食用动物合理使用和尽 可能少使用抗菌素" 免疫增强剂是无害#无污染的绿 色环保产品!在水产养殖中的应用前景是诱人的" 从 食品的安全性# 人类的健康和环境保护的角度来讲! 免疫增强剂作为水产饲料添加剂符合可持续发展的 要求!是饲料业发展的必然方向" 本课题的总体目标 是研究开发先进#稳定的对虾和贝类非特异性免疫增 强剂!研究产品的应用技术!并实现产业化生产" ! 课题取得的主要成果 对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 是国家高技术研究发展计划$%56 计划%海洋生物技术 主题在’十五(期间设立的唯一一项关于水产饲料添 加剂的课题" 该课题研究了免疫增强剂作为饲料添加 剂在对虾#鲍鱼全周期养殖期间以及作为药物浸浴剂 在对虾#扇贝#鲍鱼育苗期的应用技术!重点解决了最 佳使用时机#持续时间以及使用剂量等" 7!7 建立了完善的免疫指标体系 通过对来自未发病虾池#发病虾池和曾发病虾池 大量对虾样品的多项免疫指标及感染白斑综合症病 毒状况的综合分析和测定! 进行了白斑综合症病毒 8199:;感染与对虾的相关免疫因子的相关性研究$见 图 7%" 研究结果证实)199: 感染与对虾血淋巴酚氧 化酶活性和碱性磷酸酶相对活性密切相关!如果对虾 机体的酚氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较高水平时! 对虾即使已感染了病毒也不会发病!但对虾机体的酚 氧化酶和碱性磷酸酶活性处于较低水平时!潜伏感染 的对虾可引发病毒的迅速增殖!乃至发病*发病虾的 各项免疫指标其平均值低于未发病虾*对虾感染病毒 可引发机体过氧化物酶活性显著降低" 此外!酸性磷 酸酶活性#血淋巴吞噬活性#血细胞密度等指标也与 对虾病毒感染关系密切" 因此!以对虾病毒感染与机体免疫的相关关系为 基础!在国际上首次正式确认对虾病毒感染与机体免 疫密切相关的免疫指标 $& 个%++酚氧化酶活性#碱 性磷酸酶活性#酸性磷酸酶活性#血细胞密度#淋巴细 胞吞噬活性! 作为多糖类免疫增强剂筛选的敏感指 标!这为筛选出高效稳定的免疫增强剂奠定了理论基 对 虾 和 贝 类 非 特 异 性 免 疫 增 强 剂 的 研 制 与 应 用 谭北平 谭北平!中国海洋大学!教授!博士生导师!!55""6!青岛" 收稿日期)!""&)"6)75 ! 国家高技术研究发展计划$ %56 计划%课题成果$ !""7<<5!! "5" 和 !""6<<5!!"5"% """"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""# """"" "$%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%$ """"$ , 饲料工业-.!""" 年第 !# 卷第 !$ 期 专 家 论 坛 ) 7 )
专家论坛 谭北平:对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 发病群体 买运总 迎监 发病耐过未病未病 群体群体群体A群体B 感染 图1对虾病毒感染与机体免疫之间的关系 础 去的18%提高到25%;生产能力也明显提高,月生产 1.2进一步优化了β-1,3-D-葡聚糖制剂的生产工能力达到10。 艺,使制剂中活性成分的含量由过去的18%提高到 主要工艺技术参数:高压加工压力40MPa,控制 25%。生产能力达到月产10。 反应pH65,反应温度55℃,时间8h,后处理酸度调整 12.1生产工艺 为pH40,喷雾干燥前浓度35%,进风与出风温度分别 在前期的研究工作基础上,通过改进细胞壁酶解在195℃和85℃。B-1,3-D-葡聚糖制剂产业化的工艺 技术、滤渣后处理技术,制剂中活性成分含量已由过流程见图2。 其它原料 菌株筛选→接种培养→扩大培养→前处理→提取 β-1,3-D-葡聚糖制剂←干燥←后处理 应用效果研究 应用技术研究 标准化与产业化生产与推广应用 图2B-13-D-葡聚糖制剂产业化的工艺流程 122产品的主要技术指标 不高于5%。产品为淡黄色或接近白色粉末;无异常气 1.2.2.1产品中主要活性成分的含量经中国科学院味和滋味;流动性好、不吸潮、不结块。铅、砷、汞、镉等 广州化学研究所分析室的检测,产品中β-1,3/1,6-葡重金属的含量符合食品级要求 聚糖含量大于25%。 12.3产品的应用效果 12.22产品的主要技术指标和水平产品中活性成1.2.3.1室内饲养试验 分含量不低于25%,水分小于7%,粗脂肪不高于0.5%。 研究了从啤酒酵母泥悬液中提取的β-1,3/1,6 产品保质期在12个月以上。产品细度:200目筛上物葡聚糖制剂(含25%B-1,3/1,6-葡聚糖)对南美白对 o1994-2007chinaAcademicJournalElectronicPub2shingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
础! !"# 进一步优化了 !$!"%$&$葡聚糖制剂的生产工 艺" 使制剂中活性成分的含量由过去的 !’(提高到 #)(! 生产能力达到月产 !*+! !"#"! 生产工艺 在前期的研究工作基础上"通过改进细胞壁酶解 技术#滤渣后处理技术"制剂中活性成分含量已由过 去的 !’(提高到 #)($生产能力也明显提高"月生产 能力达到 !*+! 主要工艺技术参数%高压加工压力 ,*-./"控制 反应 012")"反应温度 ))!"时间 ’3"后处理酸度调整 为 01,"*"喷雾干燥前浓度 %)("进风与出风温度分别 在 !4)!和 ’)!! !$!"%$&$葡聚糖制剂产业化的工艺 流程见图 #! !"#"# 产品的主要技术指标 !"#"#"! 产品中主要活性成分的含量 经中国科学院 广州化学研究所分析室的检测"产品中 !$!"%5!"2$葡 聚糖含量大于 #)(! !"#"#"# 产品的主要技术指标和水平 产品中活性成 分含量不低于 #)("水分小于 6("粗脂肪不高于*")(! 产品保质期在 !# 个月以上! 产品细度%#** 目筛上物 不高于 )(! 产品为淡黄色或接近白色粉末$无异常气 味和滋味$流动性好#不吸潮#不结块! 铅#砷#汞#镉等 重金属的含量符合食品级要求! !"#"% 产品的应用效果 !"#"%"! 室内饲养试验 研究了从啤酒酵母泥悬液中提取的 !$!"%5!"2$ 葡聚糖制剂&含 #)(!$!"%5!"2$葡聚糖’对南美白对 专 家 论 坛 谭北平!对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 $ # $
谭北平:对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 专家论坛 虾生长及免疫力(酚氧化酶活性、血细胞吞噬活性以(P0.05)。以下同 复合维生素 氯化胆碱(50%) 饲料中添加B-1315-葡聚糖制剂对南美白对虾 定C(35%; Roche) 免疫力产生显著影响(表3)。当饲料中添加B-1,3/1 注:*由青岛玛斯特生物技术有限公司友情提供 6-葡聚糖制剂≥0.1%时,血细胞总量、吞噬百分数 噬指数以及酚氧化酶活性等指标均显著高于(P 料中β-1,3/1,6-葡聚糖制剂添加量的升高而上升,当005)。平均每个血细胞吞噬的异物数(ABPC)在对照 添加量≥0.2%时,试验组的增重率显著高于对照组组与试验组之间均无显著差异(P>0.05)。 表3饲料中添加β-葡聚糖制剂对南美白对虾免疫力的影响平均值±标准差,n=4) 血细胞总量 酚氧化酶活性 (x107/ml) 吞噬百分比 吞噬指 ABPC 对照组 2.08±0.2 4.2±19 17.0±1.9° 0.1%β-葡聚糖 4.31±0.4 13.2±04 10.3±1.6b 4.8±1 324±5.2b 葡聚糖 5.42±0.5 156±1.3 12.5±2.5 49±1.4 41.2±5.9 β-葡聚糖 4.8±1.2b 393±44 饲料中添加β-1,3/1,6-葡聚糖制剂显著提高对观察了攻毒后14d内对照组和试验组对虾的死 虾血细胞活性氧的产量。添加β-1,3/1,6-葡聚糖制剂亡情况并统计了累计死亡率(图4)。对照组的累计死 的试验组,相对活性氧产量(RAP)是对照组的1.89亡率显著高于添加β-葡聚糖制剂的3个试验组,至 212倍,但阝-1,3/1,6-葡聚糖制剂的添加量(≥攻毒后第7d,对照组的累计死亡率为33%而试验 0.1%)对活性氧产量无显著影响(图3)。 组的仅为50%-66%;至第14d,对照组的累计死亡率 为80%而试验组的仅为16.6%-20.0%(图4表4)。在 b 攻毒后的14内,3个试验组的对虾死亡情况和累计 死亡率很接近,彼此之间无显著差异。 计算了试验组的免疫保护力(表4)。至攻毒后第 7d,试验组的免疫保护力为80.25%~84.85%,3个试验 组之间无显著差异;至第14d,试验组的免疫保护力为 对照组01%葡案糖0.2%葡聚糖D4%葡聚 75.0%-80.0%,3个试验组之间仍无显著差异。 图3南美白对虾血细胞相对活性氧产量 12.3.2大田推广应用效果 o1994-2007ChinaAcademicJournaleLectronicPub3shingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
虾生长及免疫力!酚氧化酶活性"血细胞吞噬活性以 及超氧阴离子!"# $ %产量等#的影响$ 基础饲料!表 &#中 分别添加 ’ 个水平!()&*%+)#*和 +),*#的 !$葡聚糖 制剂配制成 ’ 种试验饲料% 以基础饲料作为对照组$ 试验饲料采取间隔投喂的策略%即每投喂 &-. 试验饲 料后再投喂 &-. 对照饲料%整个饲养试验持续 /+.$ 表 & 基础饲料配方! *# 原料 鳀鱼粉 豆粕 小麦粉 肉骨粉 虾壳粉 卵磷脂 胆固醇 鱼油 复合矿物盐 0 复合维生素 1 氯化胆碱2-(*3 安定 4 2’-*5 6789:3 含量 ,+)+ ##)+ #’);- ,)+ -)+ &)- +)- &)- &)+ +)’ +)’ +)+- 注&1 由青岛玛斯特生物技术有限公司友情提供’ 饲料中添加 !$&%’?+)+-#% 但添加量为 +)#=和 +),=的试验组之间差 异不显著(相应地%饲料系数随着饲料中 !$&%’!+)+-#对 照组%但 ’ 个试验组之间差异不显著’/+. 的饲养试验 期间%成活率都很高!@,)/A="&++=#%各处理间差异 不显著’ 表 # 南美白对虾的增重率"饲料系数和存活率 ! 平均值#标准差%BC,# 饲料 对照组 +)&=!D葡聚糖 +)#=!$葡聚糖 +),=!$葡聚糖 增重率 2=3 ,/#)&#$-&),@E -&&),A$’,)&-EF /+,)-/$#;)#@F -@’);;$’+)#-F 饲料系数 &)’@$+)&&F &)##$+)&-E &)&@$+)+-E &)#+$+)+#E 存活率!=# @,)/A$/)&& &++)++$+)++ @;)/A$#)’& @;)/A$#)’& 注& 同一列数据右上角具有相同英文字母的% 表示差异不显著 !>%+)+-#’ 以下同’ 饲料中添加 !D&G’?+)+-# 对照组%但随着 !$葡聚糖制剂添加量的进一步上升% 上述免疫指标始终维持在一个相对恒定的水平!>H +)+-#’ 平均每个血细胞吞噬的异物数!IJ>4#在对照 组与试验组之间均无显著差异!>H+)+-#’ 对照组 +)&=!D葡聚糖 +)#=!D葡聚糖 +),=!D葡聚糖 血细胞总量 !&&+A 4 ,)#$&)@E ,);$&)’F ,)@$&),F ,);$&)#F 酚氧化酶活性 !MPQ# &A)+$&)@E ’#),$-)#F ,&)#$-)@F ’@)’$,),F 吞 噬 活 性 项 目 表 ’ 饲料中添加 !D葡聚糖制剂对南美白对虾免疫力的影响! 平均值$标准差%BC,# 饲料中添加 !’(%)<(%*’葡聚糖制剂显著提高对 虾血细胞活性氧的产量’添加 !’(%)<(%*’葡聚糖制剂 的试验组%相对活性氧产量!+,-#是对照组的 (./0" 1.(1 倍% 但 !’(%)<(%*’葡聚糖制剂的添加量!! 2.(3#对活性氧产量无显著影响!图 )#’ #)- # &)- & +)- + 相 对 活 性 氧 产 量 对照组 +)&*葡聚糖 +)#*葡聚糖 +),*葡聚糖 E F F F 图 ’ 南美白对虾血细胞相对活性氧产量 观察了攻毒后 &,. 内对照组和试验组对虾的死 亡情况并统计了累计死亡率!图 ,#’ 对照组的累计死 亡率显著高于添加 !D葡聚糖制剂的 ’ 个试验组%至 攻毒后第 A.%对照组的累计死亡率为 ’’)’*G而试验 组的仅为 -)+*"/)/*(至第 &,.%对照组的累计死亡率 为 ;+*G而试验组的仅为 &/)/*"#+)+*!图 ,"表 ,#’在 攻毒后的 &,. 内%’ 个试验组的对虾死亡情况和累计 死亡率很接近%彼此之间无显著差异’ 计算了试验组的免疫保护力!表 ,#’ 至攻毒后第 A.%试验组的免疫保护力为 ;+)#-*";,);-*%’ 个试验 组之间无显著差异(至第 &,.%试验组的免疫保护力为 A-)+*";+)+*%’ 个试验组之间仍无显著差异’ &)#)’)# 大田推广应用效果 谭北平!对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 专 家 论 坛 D ’ D
专家论坛 谭北平:对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 湛江、海南等地的高位虾池全周期养殖试验结果1233B-葡聚糖制剂在中国对虾育苗中的应用 显示,南美白对虾成活率比对照组提高20%以上 分别用5种不同浓度(0,0.1,0.3,0.5,1mg/m)的 料系数降低15%-20%。 β-葡聚糖溶液对中国对虾蚤状、糠虾幼体进行3h浸 浴,48h后用浓度为5.9×l0 cfu/ml的副溶血弧菌(Ⅴib- 08 rio parahaemolyticus)进行攻毒。攻毒后再养殖48h。结 果显示,0.10.3和05mg/ml处理组均显著提高(P 005)。本研究结果表明,β-葡聚糖可以作为免疫增强 剂在中国对虾育苗阶段使用,建议浸浴使用的浓度为 0.3-0.5mgml 246810121416 13进一步改进了A3a肽聚糖制剂的中试工艺 攻毒后天数(d) 在以前的研究工作基础上,采用PVC材料的自 图4攻毒后对虾累计死亡情况 制发酵罐,简化了发酵步骤,提高了发酵产量。采纳了 表4攻毒后7d、14d南美白对虾的免疫保护力【平均值±标准差,n=2X% 攻毒后7d 攻毒后14d 免疫保护力 累计死亡率 免疫保护力 对照组 33.3±15b 80.0±5.5 0.1%β-葡聚糖 6.6±1.2 80.25±4.8 20.0±2.4 75.0±63 02%β-葡聚糖 5.0±2.3 84.85±5.2 16.6±3.2 80.0±5.1 0.4%B-葡聚糖 84.85±52 16.6±3.2 80.0±5.1 注:*免疫保护力=1-试验组累计死亡率/对照组累计死亡率]100%。 酸沉降和离心相结合的菌体收集方式,产能明显提水体中分离微生态菌株。菌株的分离采用常规的细菌 高。 分离技术,有益微生态菌株的筛选采用与过病原微生 14对虾专用复合微生态制剂的研制与应用 物的培养抑制试验、对虾口服和各种浓度浸浴等对照 1.41微生态制剂功能菌株的分离、筛选和鉴定 进行,菌株的鉴定通过快速鉴定试剂盒结合生化及分 对虾微生态制剂功能菌株的分离、筛选和鉴定技子生物学鉴定技术进行。 术:在对虾病毒感染相关免疫的基础上,考察正常和1.4.2产业化工艺流程及关键技术(图5) 病毒感染耐过对虾的微生态菌群,从对虾肠道或养殖1.42.1功能菌株的筛选 菌株分离、筛选♂接种培养→种子罐培养→生产罐培养 过筛←干燥←特殊包被←排放培养液 质检→对虾专用微生态制剂 图5对虾专用微生态制剂工艺流程 目前市场上的微生态菌株大多都是从陆生环境微生态菌群,在此基础上筛选微生态制剂用于防御对 或畜禽动物体内分离出来的,因此由这些菌株生产出虾病毒感染具有重要创新。 来的微生态制剂对水产动物的作用是有限的。利用科14.2.2特殊的包被、干燥工艺 学的方法和创新的思路,分离筛选出对虾或贝类专用 微生态制剂发挥作用的一个前提条件就是产品 微生态菌株将具有十分重要的意义。在对虾病毒感染中的活菌要能在试验动物肠道内存活并增殖。由于对 相关免疫的基础上,考察正常和病毒感染耐过对虾的虾、贝类(比如鲍鱼)饲料特殊的制粒工艺(高温、高 o1994-2007chinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
湛江!海南等地的高位虾池全周期养殖试验结果 显示" 南美白对虾成活率比对照组提高 !"#以上"饲 料系数降低$%#!!"## &" ’" (" )" %" *" +" !" $" " 累 计 死 亡 率$#% ! * ) ’ $" $! $* $) 对照组 ",$#葡聚糖 ",!#葡聚糖 ",*#葡聚糖 攻毒后天数$-% 图 * 攻毒后对虾累计死亡情况 $,!,+,+ !.葡聚糖制剂在中国对虾育苗中的应用 分别用 % 种不同浓度 $"/ ",$"",+"",%"$01203%的 !.葡聚糖溶液对中国对虾蚤状& 糠虾幼体进行 +4 浸 浴"*’4 后用浓度为 %,&"$") 567203 的副溶血弧菌$89:# ;9;>4>?0 肽聚糖制剂的中试工艺 在以前的研究工作基础上" 采用 C8G 材料的自 制发酵罐"简化了发酵步骤"提高了发酵产量# 采纳了 注’H 免疫保护力IJ$.试验组累计死亡率 $ 对照组累计死亡率K"$""## 累计死亡率 ++,+%$,%: ),)%$,!> %,"%!,+> %,"%!,+> 免疫保护力 ’",!%%*,’ ’*,’%%%,! ’*,’%%%,! 累计死亡率 ’","%%,%: !","%!,*> $),)%+,!> $),)%+,!> 免疫保护力 (%,"%),+ ’","%%,$ ’","%%,$ 攻毒后 (- 对照组 ",$#!.葡聚糖 ",!#!.葡聚糖 ",*#!.葡聚糖 饲 料 表 * 攻毒后 (-&$*- 南美白对虾的免疫保护力 H $ 平均值%标准差"LI!%$ #% 攻毒后 $*- 酸沉降和离心相结合的菌体收集方式" 产能明显提 高# $,* 对虾专用复合微生态制剂的研制与应用 $,*,$ 微生态制剂功能菌株的分离&筛选和鉴定 对虾微生态制剂功能菌株的分离&筛选和鉴定技 术’在对虾病毒感染相关免疫的基础上"考察正常和 病毒感染耐过对虾的微生态菌群"从对虾肠道或养殖 水体中分离微生态菌株# 菌株的分离采用常规的细菌 分离技术"有益微生态菌株的筛选采用与过病原微生 物的培养抑制试验&对虾口服和各种浓度浸浴等对照 进行"菌株的鉴定通过快速鉴定试剂盒结合生化及分 子生物学鉴定技术进行# $,*,! 产业化工艺流程及关键技术$图 %% $,*,!,$ 功能菌株的筛选 图 % 对虾专用微生态制剂工艺流程 菌株分离、筛选 ! 接种培养 ! 种子罐培养 ! 生产罐培养 过 筛 " 干 燥 " 特殊包被 " 排放培养液 # # 质 检 ! 对虾专用微生态制剂 目前市场上的微生态菌株大多都是从陆生环境 或畜禽动物体内分离出来的"因此由这些菌株生产出 来的微生态制剂对水产动物的作用是有限的# 利用科 学的方法和创新的思路"分离筛选出对虾或贝类专用 微生态菌株将具有十分重要的意义# 在对虾病毒感染 相关免疫的基础上"考察正常和病毒感染耐过对虾的 微生态菌群"在此基础上筛选微生态制剂用于防御对 虾病毒感染具有重要创新# $,*,!,! 特殊的包被&干燥工艺 微生态制剂发挥作用的一个前提条件就是产品 中的活菌要能在试验动物肠道内存活并增殖# 由于对 虾&贝类$比如鲍鱼%饲料特殊的制粒工艺$高温&高 专 家 论 坛 谭北平!对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 . *
谭北平:对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 专家论坛 压、高湿),就需要筛选出耐受性强的菌株,同时还要果,成活率提高,饲料系数下降。 采取特殊包被、干燥工艺。 15复合免疫增强剂的研制与应用 通过探索微生态制剂特殊包被工艺来提高饲料1.51产品的研制 中的活菌数目。通常,微生态制剂在饲料加工制粒时 从27个精心设计的复合免疫增强剂配方中筛选 的高温高压下大量失活,难以发挥其作用效果,利用出了效果明显且稳定的对虾专用复合免疫增强剂配 特殊的包被工艺来“包裹”菌株,从而提高微生态菌抗方2个、鲍鱼专用复合免疫增强剂配方1个,相关产 高温、高压、高湿的能力。同时,采用超低温冷冻工艺品的配方生产工艺已申请国家发明专利,并已实现产 对乳酸菌和节杆菌等进行干燥。 业化生产 14.3产品的企业标准 1.5.2应用研究 产品由芽孢杆菌、乳酸菌、节杆菌等8株菌组成,1.5.21室内试验 菌含量不小于10°CFU/g;水分不高于7%,粗脂肪不高 研究了对虾用复合免疫增强剂(产品代号:DX 于05%。在常温下保存6个月以上不失效。产品细M,专利申请号:031121144和对虾用复方中草药免 度:200目筛上物不高于5%。产品为淡黄色或接近白疫增强剂(产品代号:DX-M2专利申请号:03112136) 色粉末;无异常气味和滋味;流动性好、不吸潮、不结对南美白对虾生长、存活以及免疫力和抗病力的影响。 块。铅、砷、汞、镉等重金属的含量符合食品级要求。 基础饲料中分别添加2个水平(0.1%和0.2%)的 144产品的应用效果 DX-M或DX-M2,配制成4种试验饲料,以基础饲 144.1室内试验 料作为对照组。试验饲料采取连续投喂的策略,整个 做了18株益生菌对弧菌的拮抗试验,从中筛选饲养试验持续60d。 出弧菌拮抗菌。选用4株指示弧菌,分别是1594(漂浮 饲料中添加DX-M1或DX-M2显著促进南美白 弧菌)、1623(沙蚕弧菌)、1614(副溶血弧菌)、E3-110对虾生长、降低饲料系数。60的饲养试验期间,成活 弧菌)。结果表明,在有拮抗作用的18株菌中,有8株率都很高(9187%-100,各处理间差异不显著。 作用明显:菌株E5对1614、1623和E3-11均有明显 表5南美白对虾的增重率、饲料系数和存活率 拮抗作用,对1594有较弱拮抗作用;菌株N6对E3 (平均值±标准差,n=3) 11和1623均有明显拮抗作用,对1594和1614有较 增重率(% 饲料系数 存活率(%) 弱拮抗作用;菌株N3对E3-11有明显拮抗作用;菌 对照组5286±4541.31±0.1091.87±721 株En对E3-1、1614和1623均有明显拮抗作用,对02%Dx-M16543+35219+059467±2.79 1594有较弱拮抗作用;菌株Nn对1623有明显拮抗01%DX-M26680139512140029846+312 作用,对1594有较弱拮抗作用;XWE-2和J-B对4 种菌株均有明显的拮抗作用。 饲料中添加DX-M1或DX-M2对南美白对虾免 研究了饲料中添加对虾专用微生态制剂对南美疫力产生显著影响。当饲料中添加DX-M1或DX 白对虾主要免疫指标的影响。饲料中对虾专用微生态M2≥0.%时,吞噬百分数、吞噬指数以及酚氧化酶活 制剂的添加量设3个梯度:0.1%,0.2%和04%。饲养性等指标均显著高于(P005)。但血细胞总量、平均每个血细胞 磷酸酶活性、血细胞总数等主要免疫指标提高1-3吞噬的异物数(ABPC)在对照组与试验组之间均无显 倍。3个梯度之间无显著差异,表明在本试验条件下,著差异(P>0.05)。 饲料中对虾专用微生态制剂的添加量为0.1% 观察了白斑病毒匀浆液注射攻毒后7d内对照组 144.2大田应用 和试验组对虾的死亡情况并统计了累计死亡率(见图 海南150亩高位精养虾池试验结果:对虾成活率6)。对照组的累计死亡率显著高于添加复合免疫增强 提高21.4%,饲料系数0.98,比对照组降低19.2%。广剂DX-M1或DX-M2的试验组,至攻毒后第6d,对照 东珠海100亩普通虾池选点试验结果表明,对虾成活组全部死亡,而试验组的仅为3%~40%。在攻毒后的 率提高23.1%,饲料系数102,比对照组降低20.7%。7d内,各试验组的对虾死亡情况和累计死亡率很接 此外,在福建龙海等地的试验也得到了类似的结近,彼此之间无显著差异 o1994-2007chinaAcademicJournalElectronicPublsshingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
压!高湿"#就需要筛选出耐受性强的菌株#同时还要 采取特殊包被!干燥工艺$ 通过探索微生态制剂特殊包被工艺来提高饲料 中的活菌数目$ 通常#微生态制剂在饲料加工制粒时 的高温高压下大量失活#难以发挥其作用效果#利用 特殊的包被工艺来%包裹&菌株#从而提高微生态菌抗 高温!高压!高湿的能力’ 同时#采用超低温冷冻工艺 对乳酸菌和节杆菌等进行干燥’ !"#"$ 产品的企业标准 产品由芽孢杆菌!乳酸菌!节杆菌等 % 株菌组成# 菌含量不小于 !&’ ()*+,(水分不高于 -.#粗脂肪不高 于 &"/.’ 在常温下保存 0 个月以上不失效’ 产品细 度)1&& 目筛上物不高于 /.’ 产品为淡黄色或接近白 色粉末(无异常气味和滋味(流动性好!不吸潮!不结 块’ 铅!砷!汞!镉等重金属的含量符合食品级要求’ !"#!# 产品的应用效果 !"#"#"! 室内试验 做了 !% 株益生菌对弧菌的拮抗试验# 从中筛选 出弧菌拮抗菌’选用 # 株指示弧菌#分别是 !/’#*漂浮 弧菌"+!01$*沙蚕弧菌"!!0!#*副溶血弧菌"!2$3!!*鳗 弧菌"’ 结果表明#在有拮抗作用的 !% 株菌中#有 % 株 作用明显) 菌株 2/ 对 !0!#!!01$ 和 2$4!! 均有明显 拮抗作用#对 !/’# 有较弱拮抗作用(菌株 50 对 2$4 !! 和 !01$ 均有明显拮抗作用# 对 !/’# 和 !0!# 有较 弱拮抗作用( 菌株 5$ 对 2$4!! 有明显拮抗作用(菌 株 26 对 2$4!!!!0!# 和 !01$ 均有明显拮抗作用#对 !/’# 有较弱拮抗作用( 菌株 56 对 !01$ 有明显拮抗 作用# 对 !/’# 有较弱拮抗作用(78241 和 94: 对 # 种菌株均有明显的拮抗作用’ 研究了饲料中添加对虾专用微生态制剂对南美 白对虾主要免疫指标的影响’ 饲料中对虾专用微生态 制剂的添加量设 $ 个梯度)&"!;74 ?!74?174?! 或 >74?1#配制成 # 种试验饲料#以基础饲 料作为对照组’ 试验饲料采取连续投喂的策略#整个 饲养试验持续 0&=’ 饲料中添加 >74?! 或 >74?1 显著促进南美白 对虾生长!降低饲料系数’ 0&= 的饲养试验期间#成活 率都很高*’!"%-;"!&&;"#各处理间差异不显著’ 表 / 南美白对虾的增重率!饲料系数和存活率 * 平均值#标准差#6@$" 饲料 对照组 &"!; >74?! &"1; >74?! &"!; >74?1 &"1; >74?1 增重率 A.B /1%"0$#/"#C 0#!"$$#0"1D 0/#"$$$/"1D 00%"&$$’"/D 0$1"%$$1"1D 饲料系数 !"$!$&"!&D !"!%$&"!1C !"!’$&"&/C !"1!$&"&1C !"1!$&"&1C 存活率*." ’!"%-$-"1! !&&"&&$&"&& ’#"0-$1"-’ ’%"#0$$"!1 ’0"1$$1"/0 饲料中添加 >74?! 或 >74?1 对南美白对虾免 疫力产生显著影响’ 当饲料中添加 >74?! 或 >74 ?1!&"!.时#吞噬百分数!吞噬指数以及酚氧化酶活 性等指标均显著高于*EF&"&/"对照组#但随着添加量 的进一步上升#上述免疫指标始终维持在一个相对恒 定的水平*EG&"&/"’ 但血细胞总量!平均每个血细胞 吞噬的异物数*H:E("在对照组与试验组之间均无显 著差异*EG&"&/"’ 观察了白斑病毒匀浆液注射攻毒后 -= 内对照组 和试验组对虾的死亡情况并统计了累计死亡率*见图 0"’ 对照组的累计死亡率显著高于添加复合免疫增强 剂 >74?! 或 >74?1 的试验组#至攻毒后第 0=#对照 组全部死亡#而试验组的仅为 $$;%#&;’ 在攻毒后的 -= 内# 各试验组的对虾死亡情况和累计死亡率很接 近#彼此之间无显著差异’ 谭北平!对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 专 家 论 坛 4 / 4
专家论坛 谭北平:对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 表6饲料中添加DX-M1或DX-M2对南美白对虾免疫力的影响平均值±标准差,n=4) 血细胞总量 吞噬活性 酚氧化酶活性 (×107/ml) 吞噬百分比 吞噬指数 ABPC (U/min. mg Pr) 对照组 58±0.3 5.9±0.2 2.1±0.2 4.5±14 14.0±1.82 0.1%DX-M1 2.67±0.2 13.7±0.4 112±14 4.9±1.6° 37.2±6.1b 0.2%DX-M1 2.42±0.2 .8±1.13 142±2.3 4.9±1.6 40.3±46 0.1%DX 165±1 125±202 4.7±1.7 7.9±49 0.2%DX 15.7±14 4.7±1 39.1±7.3 计算了试验组的免疫保护力。至攻毒后第7d,试 现在,基因技术已经渗入益生菌产品的生产中, 验组的免疫保护力为5%-67%,各试验组之间无显使单个菌株的作用向多元化方向发展,培育出高耐受 著差异 力、高活性、具有多重作用的基因工程菌。比如将芽孢 杆菌中的芽孢移植到无芽孢的乳酸菌菌属上,使之变 成耐高温的菌种;通过基因工程手段获得一些非肠道 正常菌群的工程益生菌,使其能在肠道中“永久”定 对照组 居,使其能更好地发挥益生作用;运用基因工程技术 01%DX-M1研究功能微生态制剂,通过对一些优良菌种的遗传改 0%DX-M2造,导入有用基因如必需氨基酸合成酶基因、疫苗抗 02-M2原决定簇基因和生长激素基因等,让工程菌在肠道内 就能产生某种必需氨基酸或某种病原菌的免疫保护 蛋白刺激机体产生抗体或生长激素等,从而减少氨基 酸、抗生素或促长剂的使用。 随着分子生物学技术的迅速发展和先进生产工 攻毒后天数(d) 艺与微囊技术的应用,可以利用基因工程技术培育我 图6攻毒后对虾的死亡情况 们所需特性的新菌株,同时可大幅度地提高微生物制 152.2大田应用效果 剂的稳定性,必将为水产饲料微生物添加剂的应用提 ①广西120亩普通池选点试验结果表明,单造平供广阔的前景,水产饲料微生物添加剂将作为抗生 均亩产1010kg;对虾成活率提高291%,饲料系数素、化学促生素的替代物而成为饲料工业中最有前途 1.02,比对照组降低21%。广东湛江100亩高位虾池的添加剂之 选点试验结果表明,单造平均亩产1780kg;对虾成活 率提高19.2%,饲料系数1.0,比对照组降低20% 作者简介 ②复合免疫增强剂用于稚鲍的养殖。鲍苗起始大 小为0.8-1.0cm,经过60d的养殖,发现添加复合免疫 谭北平,博士,教授,博士生导师。中国海洋 增强剂的饲料有显著促进生长、提高成活率的效果 大学生命科学与技术学部工作。研究方向:水产 添加组平均壳长比对照组提高26.6%,日增重提高 动物营养与饲料学 21.8%;成活率比对照组提高22%。鲍鱼大小整齐 +多年来一直从事鱼、虾、贝类营养饲料学与 此外,在广东湛江等地的试验也得到类似的效果 营养免疫学的研究,已主持完成国家级重大项 2经济效益、社会效益分析 目2项、省部级课题10余项,现在是国家863” 课题实施的3年时间里,推广销售各类免疫增强+计划课题组长、国家自然科学基金项目主持人 剂共计1000余吨,创造直接经济效益4000多万元; 国家科技攻关计划项目副组长。近5年来发表 考虑到应用于对虾、贝类养殖从而提高养殖动物产十学术论文30多篇,其中SC收录7篇EI收录 量、提升产品品质,则间接经济效益超过40000万元。+2篇。已经就水产动物复合免疫增强剂复 推广应用免疫增强剂产品,有利于减少或杜绝抗 合微生态制剂水产动物强肝剂”以及水产 生素的使用,促进健康养殖,维持水产养殖业可持续 动物诱食剂”等产品申请国家发明专利15项 发展;同时,生产绿色产品,有利于应对国际市场的 其中6项已获得授权。获国家教育部科技进步 “绿色壁垒”,增加出口创汇,克服渔农增产不增收的 等奖1项、国家海洋局科技创新二等奖1项, 尴尬现象, 广东省科技进步三等奖1项 3今后的研究方向 C1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPub6shingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
计算了试验组的免疫保护力! 至攻毒后第 !""试 验组的免疫保护力为 ##$!%!$" 各试验组之间无显 著差异! 攻毒后天数#"$ & ’ ( ) # % ! 对照组 *+&$,-./& 01’2,-./& 01&2,-./’ 01’2,-./’ &’0 &00 30 %0 )0 ’0 0 累 计 死 亡 率#2$ 图 % 攻毒后对虾的死亡情况 &1#1’1’ 大田应用效果 !广西 &’0 亩普通池选点试验结果表明"单造平 均亩产 & 0&045%对虾成活率提高 ’61&2"饲料系数 &10’" 比对照组降低 ’&2& 广东湛江 &00 亩高位虾池 选点试验结果表明"单造平均亩产 & !3045%对虾成活 率提高 &61’2"饲料系数 &10"比对照组降低 ’02& "复合免疫增强剂用于稚鲍的养殖& 鲍苗起始大 小为 013!&1078"经过 %0" 的养殖"发现添加复合免疫 增强剂的饲料有显著促进生长’ 提高成活率的效果! 添加组平均壳长比对照组提高 ’%1%29 日增重提高 ’&132%成活率比对照组提高 ’’2! 鲍鱼大小整齐! 此外"在广东湛江等地的试验也得到类似的效果! ! 经济效益!社会效益分析 课题实施的 ( 年时间里"推广销售各类免疫增强 剂共计 & 000 余吨"创造直接经济效益 ) 000 多万元% 考虑到应用于对虾’ 贝类养殖从而提高养殖动物产 量’提升产品品质"则间接经济效益超过 )0 000 万元! 推广应用免疫增强剂产品"有利于减少或杜绝抗 生素的使用"促进健康养殖"维持水产养殖业可持续 发展%同时"生产绿色产品"有利于应对国际市场的 (绿色壁垒)"增加出口创汇"克服渔农增产不增收的 尴尬现象& " 今后的研究方向 现在" 基因技术已经渗入益生菌产品的生产中" 使单个菌株的作用向多元化方向发展"培育出高耐受 力’高活性’具有多重作用的基因工程菌& 比如将芽孢 杆菌中的芽孢移植到无芽孢的乳酸菌菌属上"使之变 成耐高温的菌种%通过基因工程手段获得一些非肠道 正常菌群的工程益生菌" 使其能在肠道中 (永久)定 居"使其能更好地发挥益生作用%运用基因工程技术 研究功能微生态制剂"通过对一些优良菌种的遗传改 造"导入有用基因如必需氨基酸合成酶基因’疫苗抗 原决定簇基因和生长激素基因等"让工程菌在肠道内 就能产生某种必需氨基酸或某种病原菌的免疫保护 蛋白刺激机体产生抗体或生长激素等"从而减少氨基 酸’抗生素或促长剂的使用& 随着分子生物学技术的迅速发展和先进生产工 艺与微囊技术的应用"可以利用基因工程技术培育我 们所需特性的新菌株"同时可大幅度地提高微生物制 剂的稳定性"必将为水产饲料微生物添加剂的应用提 供广阔的前景" 水产饲料微生物添加剂将作为抗生 素’化学促生素的替代物而成为饲料工业中最有前途 的添加剂之一& 吞噬活性 项 目 表 % 饲料中添加 ,-./& 或 ,-./’ 对南美白对虾免疫力的影响* 平均值"标准差":;)$ 对照组 01&2 ,-$ ’1#3"01( ’1%!"01’ ’1)’"01’ ’1#%"01’ ’1%%"01( 吞噬百分比 #16"01’? &(1!"01)@ &%13"&1&@ &%1#"&1(@ !"&1)@ 吞噬指数 ’1&"01’? &&1’"&1)@ &)1’"’1(@ &’1#"’10@ &(16"’1&@ ABCD )+#"&+)? )+6"&+%? )+6"&+%? )+!"&+!? )+!"&+)? 酚氧化酶活性 *E=8F:+85 CG+$ &)+0"&+3? (!+’"%+&@ )0+(")+%@ (!+6")+6@ (6+&"!+(@ 专 家 论 坛 谭北平!对虾和贝类非特异性免疫增强剂的研制与应用 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!" ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! "!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!" ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ""作者简介" 谭北平，博士，教授，博士生导师。中国海洋 大学生命科学与技术学部工作。研究方向：水产 动物营养与饲料学。 多年来一直从事鱼、虾、贝类营养饲料学与 营养免疫学的研究，已主持完成国家级重大项 目 ’ 项、省部级课题 &0 余项，现在是国家“ 3%(” 计划课题组长、国家自然科学基金项目主持人、 国家科技攻关计划项目副组长。近 # 年来发表 学术论文 (0 多篇，其中 HDI 收录 ! 篇、JI 收录 ’ 篇。已经就“ 水产动物复合免疫增强剂”“、复 合微生态制剂”“、水产动物强肝剂”以及“ 水产 动物诱食剂”等产品申请国家发明专利 &# 项， 其中 % 项已获得授权。获国家教育部科技进步 一等奖 & 项、国家海洋局科技创新二等奖 & 项， 广东省科技进步三等奖 & 项。 < % <