植物生理学实验指导 山西农业大学农学院 植物生理学教研室
目录 实验1植物细胞的质壁分离及死活鉴定 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 二、质壁分离的不同形式 2 实验3植物组织水势测定 3 一、小液流法 3 实验7植物的溶液培养和缺素症状 4 实验8氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根活力 6 实验9硝酸还原酶活性的测定 7 一、活体法 8 实验10叶绿体色素的提取分离 9 实验11叶绿素的理化性质 11 实验12叶绿素含量的定量测定 13 实验16植物呼吸速率的测定（小筐子法） 15 实验20芽鞘伸长法测定生长素类物质 17 实验30逆境对植物细胞膜的伤害 18
实验1 植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位，原生质是细胞中有生命的部分。死、活细胞原生质的理化 性质有本质的差别。！活细胞的原生质膜系统具有半透性，可与外界溶液构成渗透系统，活细胞可 主动积累某些容质等：而死细胞丧失了这些特性。通过细胞活公染色质壁分离现象的观察，了解原 生质体的某些性质，如粘滞性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 【原理】 活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。中性红是常用的活体染 料之一，它是一种弱碱性p指示剂，变色范围在pH6.4一8.0之间（山红变黄）。在中性或微碱性 环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中分泌，山于液泡在一般情况下呈酸性反应，因 此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般 不者色：死细胞山于原生质变性凝周，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生 液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质 与细胞核染色 【仪器设备】 1.显微镜： 2.小培养皿 3.载玻片和盖玻片 4.单面刀片： 尖头镊子 6.酒精灯： 7.火柴： 8.擦镜纸： 9.吸水纸适量 【试剂】 1.0.03 %中性红溶液： 2.1mol·L硝酸御溶液 【材料】 洋葱鳞茎（或大葱假茎基部）及小麦叶片。 【方法步遥】 片较幼的洋葱鳞片 用单面刀片在繽片内侧割划成0.5cm左右的小块，用尖头镊 子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内侧向下）。若用小麦叶片为 材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片上，再将此载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将 叶片按平，右手用刀片从一个方向轻轻利去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当利到 只剩下少量叶肉细胞时要分小心，用力太重容易损伤表皮细胞 甚企只剩了 一层细胞壁 太轻 会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除小麦外其他禾本科植物也可用此法制备表皮细胞制片。将利 好的制片切成约0.5cm2小块。 2.将制好的洋葱茎内表皮或小叶片上麦皮小块投入0.03%的中性红溶被中处角5一10 min,取出 2片 在蒸馏水中稍加冲洗，在我玻片上滴1滴蒸馏水，小心地将制片半展到载玻片 上，川盖玻片，在显微镜下观察，可看到细胞壁被染成红色，而原生质和液泡均不染色。 3.将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15mi,再汽 于载玻片上镜检，将发现细胞壁脱色，而液泡却被染成深红色。 为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1m0l·L的硝酸钾溶液中浸泡10m 左右，然后取出观察。山于硝酸钾能使原生质强烈膨胀，发生帽状质壁分离，因而能清楚地区别开 1
无色透明的原生质和染成红色的液泡。 4.将步骤3中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察，会看 到原生质凝结成不均匀的凝胶状 与细胞核 起被染成红色 5,在活体染色制片中仔细寻找，可能看到个别死细胞，其细胞核因被中性红染色而呈红色，清 晰可辨。 二、质壁分离的不同形式 【原理】 植物细胞常因原生质和细胞壁结合的紧密程度或原生质的粘性大小而表现不同的质壁分离形 式。质壁分离主要有两种形式：凸形和凹形，有时扣亚币的凹形质壁分离叫做玄李形质壁分离。质 壁分离最制山凹形开始，以后或保持这一形式，成学转为凸形。保持凹形质壁分离的时长短与 原生质的粘性关系很大， 凡是原生质粘性大的， 能维持较长时间的凹形，甚至成为痉李形，而原斗 质粘性很低的，则较快地转为凸形质壁分离 本实哈路观察山于Ca2、K对原生质粘性的不同影血而发不 同形式的质壁分离现象。经C处理后，发生山形质壁分离，经 水处理后则发生凸形质壁分离.当 KNO,的高渗溶液进行长时间 质壁分离时，山于细胞质强烈膨胀、变厚，似相状包围在收缩的液 泡两端，因此称为帽状质壁分离。此时能清楚地区别无色透明的原 斗质和染成红色的液泡。 【仪器设备】 见本实验项目 【试剂】 1.0.03%中性红溶液 图1质壁分离的不同形式 2.1m01L硝酸御溶液： A.凹形质峰分离B.形质峰分离 3.1mol·L氯化钙溶液 C.帽状质分离1，细胞核2ボ 的原牛质体3液泡 【方法步骤】 1,按本实验项目一的方法，制取洋葱内表皮或小麦叶表皮活染制片各2份，分别置于载玻片上 片滴加12滴1mol,L硝酸御溶液，另一片滴九加12滴1m0l,L氯化钙落液，盖上盖玻片立 即进行镜检，可见钾盐溶液使细胞发生凸形质壁分离，放约10mn后可见帽状质壁分离：而钙盐 溶液处理的则发生凹形或痉李形质壁分离，经较长时间(10~20m)后，可能有部分细胞原生厨 全部离开细胞壁，原生质体受表面张力的影响而转变为凸形质壁分离，但绝不会发生帽状质壁分离， 可与K处理的相区别 2.从观察到的凹形、凸形、相状等不同形式的质壁分离中选择典型的细胞各绘一图，并解释观 察结果及其原理 【思考题】 L.渗透作用在植物生理上有何意义？ 2.质壁分离在细胞生理的研究上有那些用处？ 2
实验3植物组织水势测定 一、小液流法 【原理】 当植物组织和外界蔗糖溶液接触时，若组织水势小于外液渗透势，水分进入植物组织，外液浓 度增高：相反，组织水分进入外液，使外液浓度降低：若二者水势相等，组织不吸水也不失水，外 液浓府不变。溶液浓度同，比承木同。取浸过组织的游裤落液一小滴为使于观察九入少许甲烯蓝) 放入未浸植物组织的原浓度溶液中， 观察有色溶液的浮沉：液滴上浮， 表示浸过样品后溶液浓度变 小：液滴下沉，表示溶液浓度变大：若液滴不动，表示浓度未变，该溶液水势即等于植物组织水势 实际测定时，常常不易找到有色液滴不动的溶液，而是取接近植物组织水势的相邻两种溶液浓度的 半均值。 【仪器设备】 1,水势测定取样箱（大小根据需要确定，其中放湿润滤纸，保持高相对湿度）： 2.小试管(12×100mm36~48个，洗净烘干： 3.大试管：15x150mm.18-24个，洗净烘干： 4.毛细移液管：36 48个，洗净烘干 5.剪刀、刀片、打孔器、1个摄子各1把： 6.干净硬纸片：20×20cm,2张： 7.试管架：2个 【试剂】 L.燕糖溶液：按重量法试剂配制要求配制1moL燕糖溶液。2.甲烯蓝（或0.03%中性红）溶液。 【材料】 欲测的植物组织 【方法步骤】 1.取5一6个干净的小试管和相同数量的大试管(15×150mm,贴不同水势（或浓度）标签。向大 试管中加入1mole燕糖溶液分别为1、2、3、4、5、6ml,依次再加入蒸馏水为9、8、7、6,5、4ml 使各试管总体积为10mL,摇匀，即为不同浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6molc(或水势)糖 溶液。 2.剪取欲测叶片，用刀片切成0.5×0.5cm2小片，混匀，分别装入小试管底部，每瓶装8片 右。向各小试管分别加入不同水势燕神溶液4~5滴，摇匀，放一小滴甲烯蓝溶液（或中性红溶液）， 加盖保持20-30min 3.用干净的毛细移液管，吸挤小试管底部蓝色溶液，使其充分混合均匀，并吸取1一2滴，小 心地插入装若相对应同浓度燕糖溶液大试管中部，轻轻地挤出一小滴蓝色溶液，慢慢转动毛细管头 部，抽出毛细移液管，观察蓝色液滴流动方向。 【结果计算】 蓝色溶液不动的试管或蓝色液滴上浮、下沉的两个相邻试管燕糖浓度的平均值，即为等势点。 假如燕糖溶液按水势值配制，测出结果个必再进行运算。若蔗糖溶液按摩尔浓度配制，按下式 计算植物组织水势 3
=-iRTC 式中，平：山燕糖溶液换算为植物组织水势，单位为大气压，最后变为巴(1.013bar-1am, 再换算为MPa (1 MPa-10bar)片C:溶液的质量摩尔浓度(ol·kg:R: 气体常数 0.008314 MPa·L·mo.K:T绝对温度K,即273+1u为当时温度)：：解离常数（燕糖-） 【注意事项】 1小液流法中用的毛纽移液管尖端需弯成直角，以候证从滴管出来的液滴不受向下力的影 2,毛细管移液管延试管壁慢慢抽出，以防溶液振动，影响蓝色液滴的运动 实验7植物的溶液培养和素症状 植物的生长发育，除需婴充足的阳光和水分外，还需要矿质元 则植物就不能很好地生长 发育甚全导致死亡。应用溶液培养和砂基培养是研究矿质营养的重要方法，可以观察矿质元素对植 物生活的必需性：用溶液培养来研究矿质元素对植物生长发有的影用，可以避免土壤中其它因素对 植物章生的影响。近年来溶液培养方法已广泛成用于商业生产中。 【原理】 植物必需有某些必要的矿质元素的供应，才能保证正常的生长发育，如缺少某一元素，便表现 出缺素症。把这些必要的矿质元素用适当的无机盐配成培养液，即能使植物正常生长，这就是溶液 培养。应用此方法，所用元素的种类和用量可完全人为地九加以控制。要了解某元素缺多所引起的生 理病症，可从培养液中减士该元素，以便在以后的生长过程中进行观察。这类实验，通常用溶液培 养，为了管理方便，也常将溶液加入洁净的石英砂培养植物，则称为砂基培养。 【仪器设备】 1.烧杯：250、500mL各1个： 2.刻度移液管：5mL10支，1mL1支 3量筒：1000ml1个 4.黑色酷光纸适量： 5.15×15 m料纱树（或纱）：1块 6塘瓷盘（带盖）：1个 7.石英砂适量： 8.陶质花欲：1个： 9.500mL试剂瓶：11个： 10.培养缸（可用1000mL玻璃质或瓷质培养缸）：7个. 【试剂】 L.硝酸御 2.硫酸镁 3.磷 二氢钾： 5.硫酸钠： 6.磷酸二氢钠： 7.硝酸钠： 8。硝酸钙： 9.氯化钙： 10.硫酸亚侠 11.硼酸 12.氯化锰 3.硫酸 14.硫酸锌 15.钳酸： 16.款酸： 17.乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na,). 【材料】 本米、番茄、向落种子 【方法步骤】 4
1.供试苗培养：取250mL烧杯一个，在烧杯口紧扎塑料纱树或纱布一块，将烧杯放在 另一个500mL烧杯中，加水使水面几乎与内部烧杯口相平。 将浸种一夜的器茄或玉米种子均匀地排列在妙树上，在大烧杯上盖一块玻璃片，然后 放置在温暖处发茅。待子叶完全展开后，改用稀释培养液（浓度为完全培养波的14）培养 培养米苗可一直用水培养。当番茄苗高4一5cm左右，展开第一真叶或玉米幼苗出现第 真叶，选择生长一致的幼苗作实验材料，移往各种缺素溶液中。移植时注意勿损根系。有 时也可用花盆装石英砂或洁净的河沙培养苗，但移植要早些，以免伤根。 表31大量元素配置表 营养出 浓可 S0.7H0 KH.PO EDTA 两种试剂混合加热溶解) 4H,0181g 表32缺素培养液的配制 贮备液 每100mL培养液中贮各液的用量(mL) 缺N P 缺K Ca 缺Mg 缺Fe CNO,) 05 0.5 0.5 05 0.5 05 KH:PO 0.5 0.5 0 0.1 Cac NaH.PO Na.so 0.s 05 EDTA-F 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1 0. 0. 0.1 0 01 2.配制大量元素、铁盐和微量元素的贮备液：用蒸馏水按表31所列各化合物的克数， 分别配置贮备液1000mL. 配好以上中各液后，再按表32成完全培养湾和缺多其种元装的培养液（用票柳水） 3.将以上见制的培养液各800mL分别圳入1000mL培养缸中，瓶外里色酷光纸套（里 面向甲)或用报纸包三层，瓶上用马粪纸板涂腊后做成盖，并用打孔器在盖中间打一圆孔 用棉花把植株幼茎通过小孔固定在盖上，使整个根系浸入培养液中，装好后将培养瓶放了 阳光充足、温度适宜(2025℃)的地方。 4.实验开始后，每两天观察一次，用精帝pH试纸测试培养液的pH值，如pH高于6，应 以稀盐酸调整到5一6之间。注意记录缺乏必需元素时所表现的症状及最先出现症状的部位。 培养液每周史换一次。为使根系生长良好，最好应在盖与溶液之间保州一定空隙，以利通
气。待各缺素培养液中的幼苗表现出明显的症状后，将缺素培养液全部史换为完全培养液。 观察症状遂渐消失的情况，记录结果 【注意事而】 配制贮备液时务必先大量加水 一定体积，随后再加入试剂，并按顺序先加入御盐 钠盐、硝酸盐等易溶物质，待充分溶解并搅拌均匀后再加入溶解度较小的物质。 2.铁林贮备液应避光保存。 【思考题】 1。为什么说溶液培养是研究矿质背养的用要方法？ 2.根据实验结果叙述番茄、玉米、向川葵幼幼苗缺乏大量元素时所表现的症状并分析 其原因。 实验8氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根活力 根系是植物对水分和矿质背养的主要吸收器官，同时又是植物体中重要物质如氨酸 激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影脑植物个体的 生长情况、营养水平和产量水平。本实验练习测定根系吸收面积和活力的方法，以为植物 养研究提供依据 【原理】 氢化一苯基四氢唑(TC)是标准氧化还原电位为80毫伏的氧化还原色素，溶于水中 成为无色溶液，但还原后即通过下列反应，生成红色而不溶于水的三苯基甲(TT下) -c N-NCr2 NN N-N +CC +HCI AN=N- TTC(无色) TTF(红色) 生成的甲腾呈稳定的红色，不会被空气中的氧自动氧化。所以被广泛地用作酶试验的 氢受体。 植物根引起的TTC还原，可因加 入琥珀酸 延胡索酸 ,苹果酸得到加强 ,而被丙 二酸、碘乙酸所严币抑制。所以，它能够测定琥珀酸脱氢酶的活性，山该阵活性表示根系 活力。 【仪器设备】 1.721型分光光度计 2.分析天平（感量0.1mg) 3.托盘天平（感量0.1g) 4.温箱 5.研钵：1套 6.4cm漏斗：2个： 7.量简10mL:1个： 8.刻度移液管：0.5mL.2mL、5mL 9.10mL容量瓶（或10mL具塞刻度试管）：8个： 10试管架：1个： 11.石英砂活量： 12.高型称量瓶(30×60mm):2个。 【试剂】 1.乙酸乙指（分析r纯》： 6
2.连二亚硫酸钠(NaS,O4),分析纯，粉术： 3.1%TTC溶液：准确称取TT℃1.0000g,溶于少量水中，定容到100mL。用时稀释金 需要浓度： 4.0.1mol·L-pH7.5磷酸缓冲液 5.1mol·L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL,边搅拌边加入盛有500mL蒸馏 水的烧杯中，冷却后稀释1000mL: 6.0.4molL琥珀酸：称取琥珀酸4.72g,溶于水中，定容全100mL。 【材料】 水培或砂培的植物材料（需洗净），玉米浸种24左右，在实验前1周发芽做好材料准 备 【方法步骤】 1.定性测定： (1)配制反应液：把1%的TTC溶液，0.4%mol·L的琥珀酸和0.1mol·LpH7.5磷 酸缓冲液按1：5：4的此例混合。 (2)将根行 把地上部分从茎基切除。然后将根放入带盖的称量瓶中，倒入 反应液，以浸汝根为度.置37℃暗箱中1，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及侧根部 分明显地变成红色，表明该处具有活跃的脱氢南存在。 2.定量测定： (1)TTC标准曲线的制作：吸取0.1 mLTTCH标淮液（合TTC10mg·mL-)放入10nmL 容量瓶，加少许NaS,0粉 ，摇匀后即产生红色的甲。再用乙酸乙酯定容全刻度， 匀，然后分别取此液0.25、0.50、1.00、 .50、2.00mL10mL容量瓶中 乙酸乙酯定 仝刻度，即得到含甲月0.025、0.05、0.10、0.15、0.20mg的标准比色系列。以空白作参比 在485m波长下测定吸光度，绘制标准曲线。 (2)称取材料根尖1cm切段0.5g,放入称量瓶，加入1%TTC溶液和0.1molL磷酸 缓冲液的等量混合液10mL,把根充分浸没在溶液内，在37℃下保温1h。此后加入1molL 硫酸2mL,以终 反应 (3)把根取出，擦干水分后与3~5mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研体内研碎，以 提取甲濉。把红色浸提液滤入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3次，滤入试管，最 后用乙酸乙酯定容10mL。用分光光度计在波长485m下比色，以空白试验（先加入硫酸 再加入根样品，其它步骤同上)作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC还原量。 (4)计算： TTC还原强度=根重(g)×时间(h TTC还原量(g) 【注意事项】 在对材料根系的操作中切忌对根的损伤，以免对实验结果带来影响 【思考题】 试分析活力测定中根系着色深浅不同的原因。 实验9硝酸还原酶活性的测定 【原理】 ·7
硝酸还原牌是植物氮素同化的关键酶，也是一种诱导，与作物吸收和利用氮肥有关， 可催化硝酸盐还为亚硝酸盐： NO;+NADH+H"-NE>NO;+NAD'+H,O 产生的NO,在酸性条件下可以与对-氨基苯磺酸(sulfanilic acid)或磺胺（对-氨基苯 磺酰胺，sulfanil--amide)反应生成重氨盐，再与-萘胺反应生成红色偶氮化合物（对苯磺 酸-码--萦胺)。 生成的红色偶氮化合物在520m波长下有最大吸收值，可用分光光度法测定。硝酸还 原南活性可以每h每克鲜重产生的NOg数表示南活性(NO:ggW 根据材料处理不同可分为活体法与离体法，根据反应介质的不同则可分为内源基法利 外源基质法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。内源 基质法测定结果可反映硝酸还原酶在实际生长条件下的还原力，而外湖基质法测定结果则 可反映硝酸还原痕的潜在或最高还原力。 一、活体法 【仪器设备】 1.分光光度计： 2.真空绿： 3.真点空干燥器 4.天Ψ（感量0.1mg): 5.恒温培养箱： 6.角瓶(50mL): 7.1L移液管」 8.5mL移液管. 9.10mL试管 10.试管架 l.直径1cm打孔器 【试剂】 1.0.1mol·LpH7.5.酸缓冲液0 Na:HPO412H,0取30.0905g与NaHP04,2H,0 取2.4965马用蒸馏水定容全1000mL): 2.30%的三氯乙酸(30g 氯乙酸，水溶后定容全100mL): 3. 0.2 mol-LKNO 20.22gKN0,用蒸馏水定容于1000mL): 4.磺胺试剂(1g磷胺，加25mL浓盐酸，用蒸馏水定容于100mL): 5.-萘胺试剂(0.2g-萘胺，用含1mL浓盐酸的蒸馏水定容于100mL): 6.5ug·mLNO:标准夜(0.10 g NaNO2用蒸瘤水定容至100mL,吸取7.5mL,再 用蒸馏水定容至1000mL) 【材料】 欲测植物材料（叶桌类蔬菜，实验材料在实验前一天可用硝态氨肥处理，以增强硝酸还 原酶活性)。 【方法步骤】 1.标准曲线制作取7支15mL刻度试管按下表顺学试剂 2。取新鲜植物组织洗净，拭干如果是叶片可去主脉，打成直径1cm的圆片，若足 根、茎可切成0.1cm厚的薄片 试管徐号 4 6 7 5gmLO标准液ml 0.2 0,4 0.8 121.6 2.0 楼馏水mL 2.0 1.8 1.6 1.20.80.4 0.0 每个试斧中O,含量gmL 0 0.51.0 2.0 30 4.05.0 ·8
