实验一质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集 和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提 过程。 一、实验目的：学握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 二、实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段 的BAC的大肠杆菌菌液。 三、实验原理：在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的 RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质 粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 四、实验步骤： 1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养： 2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃ 摇床，250rmim过夜培养： 3.吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液：吸取1.5ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净： 4.加入300μ1溶液1振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块)： 5.加入300μ1溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，放置至消亮，一般不超过5分钟： 6.加入300μ1溶液Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀 7.12000g离心10分钟： 8.畈取800μ1上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管 中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟： 9.12000g常温腐心15分钟：
10.倒尽上清，加75%乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）： 11.室温放置或超净台上风干DNA: 12.加40μ1灭菌超纯水或TE溶解： 13.质粒、BAC的质量检测，于20℃保存 实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二、实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。 三、实验原理：在pH值为8.0~83时，核酸分子碱基儿乎不解离，磷酸全 部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为 电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现 较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染 料（如EB后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 四、实验步骤： 1,用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上 2.调整好梳子的高度： 3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至45-50℃时倒入制胶板中： 4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带： 5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中： pUC185μ1+ddH203μ1+溴酚蓝2μ1共10u1于0.5 ml tube中混合后 点样 6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动： 7.电冰完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)溶液 中染色10一15mi,消水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录
实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及 纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 一、实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克 隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUCI8载体上。 二、实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片 段，克隆载体为PUC18。 三、实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平 端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应：选择克隆载体pUCI8多 克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连：在连 接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 四、实验步骤： 1.载体pUCI8和外源DNA片段的限制性酶切： (50μ1反应体系，用1.5 ml tube,冰上操作) DNA 30l R.E 1 10×buffer5l ddH20 144 37℃反应1hr,分别取8μ1外源片段酶切产物和5μ1PUC18酶切产物 于1.0%凝胶检测酶切是否完全：按2一5步纯化、回收DNA 2.加入dd20150μ1（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，颠 倒混匀，12000g离心10min: 3.吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分 钟以上： 4.12000g4℃冷冻离心15分钟： 5.倒去上消，用75%乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10μ1ddH20 (0.5 ml tube中)，PUC18溶于20μ1ddH20(1.5 ml tube中)：
6.按以下反应去除载体PUC18的5'磷酸基团，50℃反应30min以上 DNA 20l CIAP TaKaRa 0.5μ1 10xbuffer 4.0l ddH20 15.54l 7.70℃水浴10min,使CIAP失活： 8.按2一5步纯化载体，溶于10μ1ddH20: 9.连接反应(15μ1体系)： DNA 10ul pUC18 2.5l 5xbuffer 1.5l T4 ligase(3U/Hl) 1ul 16℃水浴过夜 10.转化大肠杆菌感受态细胞 11.转化子的鉴定 实验四感受态细胞的制备 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受 体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了 不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CC12法将外 源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaC2感受态 细胞。 一、实验目的：学习感受态细胞的制备过程 二、实验材料：大肠杆菌菌株DH5a或DH1OB 三、实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷 的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的 导电离子。109~1010转化子/μgDNA: 对于热激法，是利用冰冷的CaC2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产 生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106~107转化子/μgDNA
·CaC2感受态细胞的制备的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床 培养过夜（约16小时）： 2.取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 约2.5-3小时(250-300pm): 3.将0.1MCaC12溶液置于冰上预冷： 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 6.弃去上清，加入100μ1顶冷0.1MCaC2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 8.弃去上清，加入100μ1顶冷0.1MCaC2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮： 9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%-20%甘油)后超 低温冷冻贮存备用（一70℃）。 ·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床 培养过夜： 2.取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37℃摇床上刷烈振荡培养 至0D600-0.6(约2.5-3小时)： 3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 6.弃去上清，加入1500μ1冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟
8.弃去上清，加入750μ1冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮： 9.4℃下3000g冷冻离心5分钟 10.加入20μ1冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬 浮： 11.立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。 实验五质粒的转化及转化子的鉴定 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接 产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用 多种方法筛选和鉴定目的克隆， 一、实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴 定方法。 二、实验村料：外源片段与载体的连接产物，大肠杆菌感受态细胞 三、实验原理： (1)热激法：大肠杆菌在0℃CaC2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转 化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数 小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达， 在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 (2)电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不 仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入，同时DNA在 电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 热激法转化实验步骤： 1.制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中加入250μ1Amp （100mg/ml),250μ1X-gal(20mg/ml),25μ1IPTG(200mgml),混匀后 倒入灭菌培养皿中： 2.取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化： 3.每100μ1感受态细胞加入约20g质粒DNA,3管分别加连接产物、标
准超螺旋质粒DNA(阳性对照)及不加入任何DNA(阴性对照)，用移液器 轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟： 4.热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管： 5.冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1一2分钟 6.复苏：每管加400μ1S0C培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟， 使细菌复苏： 7.涂皿：取适当体积均匀涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素(Amp)的LA 平板： 8.培养：倒置培养皿，于37℃培养12一16小时即可观察到蓝白相间的 菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化 子) 质粒电转化大胸杆菌感受态细胞操作步骤 1.制备选择性培养基平板：在融化的250mlLA培养基中加入250μ1Amp (100mg/ml),250μ1X-gal(20mg/ml),25μ1IPTG(200mg/ml,混匀后 倒入灭菌培养皿中： 2,取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化： 3.每管感受态细胞加入1μ1连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上： 4.电转化仪选择1800V作为输出电压： 5.将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，立即按下按纽电击： 6.立即加1mlS0C培养基到转化杯中重悬细胞： 7.将细胞转入合适的培养管中37℃培养1小时： 8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板： 9.37℃培养过夜，观察结果。 实验六PCR技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种休外核酸扩增系 统，是分子克隆技术中的常用技术之一。PC具有反应快速、灵敏、操作简便 等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域
一、实验目的：掌握PCR原理，学习PCR操作过程 二、实验材料：转基因水稻叶片总DNA,外源基因的特异引物 三、实验原理：PCR是在模板DNA、引物和NTPs的存在下依赖于DNA聚 合酶的酶促反应。PC技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分 为变性、退火、延仲三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片 段得到大量扩增。 四、实验步骤 1.调整模板浓度至5ngμ1： 2.按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒 Template DNA 2μ1(20ng) l0×buffer 2.0l MgC12 25mM 1.5μ1 Primer F(10uM) 0.2l Primer R(10uM) 0.2l dNTPs 2mM) 2.0μ1 Taq(5U/μl) 0.2μ1 Add ddH20 to 11.9l 3.PCR反应循环条件设置： 95℃3'1 cycle 94℃1'57℃ 1'72℃1'30"35 cycles 72℃8'1 cycle 4℃ forever 4.检测：加2μ1溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15μ1反应产物点样电泳： 5.在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳。EB染色，紫外观察