第二十章i 酶免疫技术 温州医学院检验医学院 临床免疫学检验教研室 杨建荣
第二十章 酶免疫技术 温州医学院检验医学院 临床免疫学检验教研室 杨建荣
第一节概述 一.原理 二.酶及底物
第一节 概述 一.原理 二. 酶及底物
原理 。 以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试 剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效 催化反应的专一性相结合的一种免疫检 测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原） 的免疫学活性，又保留酶对底物的催化 活性
原理 • 以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试 剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效 催化反应的专一性相结合的一种免疫检 测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原） 的免疫学活性，又保留酶对底物的催化 活性
酶及其底物 (一)酶的选择要求 ①酶活性高。 ②具有可结合的基团，标记后酶活性保持稳定， 而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 ③催化底物后产生的信号产物易于测量。 ④活性不受样品中其他成分的影响：用于均相酶 免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后， 酶活性出现抑制或激活。 ⑤对人体无危害，性质稳定，且价廉易得
酶及其底物 （一）酶的选择要求 ① 酶活性高。 ②具有可结合的基团，标记后酶活性保持稳定， 而且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 ③催化底物后产生的信号产物易于测量。 ④活性不受样品中其他成分的影响；用于均相酶 免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后， 酶活性出现抑制或激活。 ⑤对人体无危害，性质稳定，且价廉易得
ELISA中最常用的酶 ·辣根过氧化酶(HRP) 邻苯二胺(OPD)-黄 四甲基联苯胺(TMB) 蓝 ·从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶(AP) 硝基苯磷酸酯(pNPP)一黄 。B半乳糖苷酶 底物为4-甲伞酮基b-D-半乳糖苷---荧光
ELISA中最常用的酶 • 辣根过氧化酶（HRP） 邻苯二胺（OPD）----黄 四甲基联苯胺（TMB）----------------蓝 • 从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP） 硝基苯磷酸酯（pNPP）-- ---黄 • β半乳糖苷酶 底物为4-甲伞酮基-b-D-半乳糖苷 ------荧光
酶和底物 NHz NH HRP NH2 HO2 -NH +2H,O (橙红色)
酶和底物
几种酶的特点 ·HRP:分子量较小，标记物易透入细胞内，酶 及酶标记物比较稳定，易保存溶解性好 ·AP:分子量较大，不易透入细胞内，敏感性高 ·b-Gal:人血中缺乏此酶，在测定时不易受到 内源性酶的干扰，常用于均相酶免疫测定
几种酶的特点 • HRP ：分子量较小，标记物易透入细胞内，酶 及酶标记物比较稳定，易保存溶解性好 • AP：分子量较大，不易透入细胞内，敏感性高 • b-Gal：人血中缺乏此酶，在测定时不易受到 内源性酶的干扰，常用于均相酶免疫测定
制备酶结合物的方法 。戊二醛交联法 ·过碘酸盐氧化法 本法只用于HRP的交联 。以酶作为抗原与其相应抗体形成的免疫 复合物代替酶标记物
制备酶结合物的方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法 本法只用于HRP的交联 • 以酶作为抗原与其相应抗体形成的免疫 复合物代替酶标记物
酶标记物的纯化与鉴定 。酶标记物的纯化 ● ·酶标记物的鉴定 标记率、质量（酶活性和抗体（抗原） 的免疫活性)鉴定
酶标记物的纯化与鉴定 • 酶标记物的纯化 • • 酶标记物的鉴定 标记率、质量（酶活性和抗体（抗原） 的免疫活性）鉴定