3.051/BE.340 第十三讲细胞行为的定量分析 1.细胞培养 a.为何采用细胞培养? 体内(活体) 体外(如玻璃,培养基) 1.简化的模型系统 1.天然的三维环境 利 2.所有相关信号均存在 2.可独立研究各个参数 3.观察过程是时间的函数 1.多变量一噪音数据 1.非天然的二维环境 2.需考虑到动物权利等问题 2.可能会缺少重要的信号 细胞培养的类型 原代培养:直接来源于活体 原代培养 对真实生物体的功能性反射 ⑧细胞会最终死亡 ⑧一些种类的细胞不易分化(神经细胞) 细胞系:来源于原代细胞(非克隆) ③被更改的基因→可长期存活 ●被隔离的自发性突变 # 肿瘤细胞 病毒性致癌基因的传染 细胞系 时间
1 3.051/BE.340 第十三讲 细胞行为的定量分析 1. 细胞培养 a. 为何采用细胞培养？ 体内（活体） 体外（如 玻璃，培养基） 利 1. 天然的三维环境 2. 所有相关信号均存在 1. 简化的模型系统 2. 可独立研究各个参数 3. 观察过程是时间的函数 弊 1. 多变量—噪音数据 2. 需考虑到动物权利等问题 1. 非天然的二维环境 2. 可能会缺少重要的信号 b. 细胞培养的类型 原代培养：直接来源于活体 ☺ 对真实生物体的功能性反射 / 细胞会最终死亡 / 一些种类的细胞不易分化（神经细胞） 细胞系：来源于原代细胞（非克隆） ☺ 被更改的基因⇒ 可长期存活 z 被隔离的自发性突变 z 肿瘤细胞 z 病毒性致癌基因的传染 原代培养 时间 细胞系 时间
3.051/BE.340 2细胞功能的评价 附着 迁移 繁殖 分化(显型变化,如血液干细胞→白细胞) 分泌(蛋白产物) a细胞附着测试 重要性:对于细胞的其它功能而言,细胞附着是必须的一它可提供生物物理和生物化学的刺 激。 沉降测试 在体外,细胞以给定的密度(面积)被种植在适宜表面一定时间 2.轻轻地冲洗表面,并保持细胞计数,如通过光学显微镜法或 Coulter计数法(细胞分离 悬浮并测定流过狭窄通道的电阻变化达到“计数”目的)。 粘附率 (% 处理过的表面TCPS(控制) 3.为了测定细胞的阻抗,细胞种植在含有血清的培养基中比无蛋白溶液中更准确。 提示:血浆与血清 血浆一血液的液体部分(细胞被除去) 血清一除去凝血剂的血浆(如:FGN)
2 3.051/BE.340 2.细胞功能的评价 ¾ 附着 ¾ 迁移 ¾ 繁殖 ¾ 分化（显型变化，如血液干细胞 ⇒ 白细胞） ¾ 分泌（蛋白产物） a.细胞附着测试 重要性：对于细胞的其它功能而言，细胞附着是必须的—它可提供生物物理和生物化学的刺 激。 ¾ 沉降测试： 1. 在体外，细胞以给定的密度（面积）被种植在适宜表面一定时间。 2. 轻轻地冲洗表面，并保持细胞计数，如通过光学显微镜法或 Coulter 计数法（细胞分离， 悬浮并测定流过狭窄通道的电阻变化 达到“计数”目的）。 3. 为了测定细胞的阻抗，细胞种植在含有血清的培养基中比无蛋白溶液中更准确。 粘 附 率 （%） 处理过的表面 TCPS（控制） 提示：血浆与血清 血浆—血液的液体部分（细胞被除去） 血清—除去凝血剂的血浆（如：FGN）
3.051/BE.340 →沉淀测试不能给出粘附强度方面的数据 细胞铺展测试 细胞以给定密度种植在适宜表面一段时间 2.测量投影表面积的增加(光学显微镜法) 距水平仪较近,但仍不是 对粘附性的直接测量 铺展表示焦点接触的形成 代谢活动 离心试验(正交力) 1.细胞被种植在有盖24眼孔板中一段时间 2.孔板放入离心机,由于力的作用细胞粘附并可被检测出 o⊙◎○ ○○○
3 3.051/BE.340 ⇒ 沉淀测试不能给出粘附强度方面的数据 ¾ 细胞铺展测试 1. 细胞以给定密度种植在适宜表面一段时间 2. 测量投影表面积的增加（光学显微镜法） ¾ 离心试验（正交力） 1. 细胞被种植在有盖 24 眼孔板中一段时间 2. 孔板放入离心机，由于力的作用细胞粘附并可被检测出 距水平仪较近，但仍不是 对粘附性的直接测量 铺展表示焦点接触的形成 —代谢活动
3.051/BE.340 法向力 (离心分离) 剪切力(流动腔) 剪切法向 细胞100% 残余 50% F t 外加力 便于对比采用公制 流动小室测试:(剪切力) 1.细胞种植在平行的平板小室内 2.流体流动的速度梯度在细胞键合表面产生剪切力一通俗地讲像是“皱纹
4 3.051/BE.340 ¾ 流动小室测试：（剪切力） 1. 细胞种植在平行的平板小室内 2. 流体流动的速度梯度在细胞键合表面产生剪切力—通俗地讲像是“皱纹” 法向力 （离心分离） 剪切力（流动腔） 剪切 法向 细胞 残余 量 外加力 便于对比采用公制
3.051/BE.340 b.细胞迁移测试 重要性 组织培养(胚胎) 免疫和炎性应答(白血球的趋化性) ●脉管基因一内皮细胞迁移形成脉管系统 患处愈合一成纤维细胞迁移形成结缔组织 ●肿瘤转移 细胞如何迁移? 肌动蛋白结合在细胞骨架上→“薄层集落”扩张 在肌动蛋白微丝上产生收缩力 通过焦点接触,力被传递给培养基 →转录 肌蛋白丝 层聚集 焦接一 短期:细胞有方向性运动 长期:细胞运动类似于扩散过程 (非化学梯度或物理屏障)
5 3.051/BE.340 b. 细胞迁移测试 重要性： z 组织培养（胚胎） z 免疫和炎性应答（白血球的趋化性） z 脉管基因－内皮细胞迁移形成脉管系统 z 患处愈合—成纤维细胞迁移形成结缔组织 z 肿瘤转移 细胞如何迁移？ 肌动蛋白 结合在细胞骨架上 ⇒ “薄层集落 ”扩张 在肌动蛋白微丝上产生收缩力 通过焦点接触，力被传递给培养基 ⇒ 转录 短期：细胞有方向性运动 长期：细胞运动类似于扩散过程 （非化学梯度或物理屏障） 焦点接触 层聚集 肌蛋白丝
3.051/BE.340 量化途径: 1.单个细胞的测量 2.细胞群体的迁移 单个细胞的测试 延时电视显微镜跟踪表面细胞的运动(在流体或凝胶下方),该运动是时间变化的函数 1测量从起点pt行径的距离(d),该距离是时间的函数(t) 2拟合数据模型得到化学反应速度(S)和持续时间(P)(细胞依赖性) P:最初方向的记忆时间(通常min-hrs S:测量单位时间内质心的位移(通常1-50umh) 自由行程模型:1)=nS[Pt-P(-e-力 维数(2) 式中(4(0)=∑( M=测量的数目 提示:≡0,t>>P 为什么?
6 3.051/BE.340 量化途径： 1. 单个细胞的测量 2. 细胞群体的迁移 ¾ 单个细胞的测试 延时电视显微镜 跟踪表面细胞的运动（在流体或凝胶下方），该运动是时间变化的函数 1.测量从起点 pt.行径的距离(d), 该距离是时间的函数（t） 2.拟合数据模型得到化学反应速度（S）和持续时间（P）（细胞依赖性） P：最初方向的记忆时间(通常 min-hrs) S：测量单位时间内质心的位移（通常 1-50µm/h） 自由行程模型：〈d(t)2 〉 = n S2 [Pt – P2 (1-e –t/P)] 维数（2） 式中 2 1 2 1 d(t) d (t) M i M ∑ i = = M = 测量的数目 提示： ≡ 0, t >>P 为什么？
3.051/BE.340 M=假如每次停顿被用作一个单独的数据点时的细胞数 d44△t) dA(4△t) 细胞1号路经 细胞2号路经 为了达到较好的统计结果需要测量较多的细胞路经(较为枯燥!!) 间隔地,也可利用同一细胞的不同数据 策略(i):把在其轨迹上的每个点作为一个“起始点”(所有的样品点是等量的) d(4△t) d3(4△t d(4△t) 策略(ⅱ):阻断进入MM的迁移路经(N=样品间隔△t的总和) dl3(4△t d1(4t)
7 3.051/BE.340 M = 假如每次停顿被用作一个单独的数据点时的细胞数 细胞 1 号路经 细胞 2 号路经 为了达到较好的统计结果需要测量较多的细胞路经（较为枯燥！！） 间隔地，也可利用同一细胞 的不同数据： 策略（ⅰ）：把在其轨迹上的每个点作为一个“起始点”（所有的样品点是等量的） 策略（ⅱ）：阻断进入 N/M 的迁移路经（N = 样品间隔△t 的总和）
3.051/BE.340 拟合成随机行走模型 d)=nS2P1-P2(1-e- 对于短时间内t<P exp(-ax)≈|-a+c d()2)=S d02)=St穿行距离一速度x时间 (有向运动) 对于长时间内P:(d(2)=nS2Pt-nSP2 (d(t))对t作图: 10 m=nSP 时间(min) 斜率=nSP Y-截距=-nSP b= -nS P- →P和S的值
8 3.051/BE.340 拟合成随机行走模型 〈d(t)2 〉 = n S2 [Pt – P2 (1-e –t/P)] 对于短时间内 tP： 2 2 2 2 d(t) = nS Pt − nS P 穿行距离= 速度 × 时间 （有向运动） 时间（min） 〈d(t)2 〉 (µm) 〈d(t)2 〉 对 t 作图： 斜率= nS2 P Y-截距= - nS2 P ⇒ P 和 S 的值
3.051/BE.340 microvessel endothelial cells 比较在同一培养 smooth muscle cells 基上不同类型细 持续时间(P) 胞迁移的P和 mir fibroblasts ● melanoma celis 速度如何与炎性响 alveolar macrophages 应的发生顺序相 关? 速度(S)(μum/min) 摘自 D.A. Lauffenburger和 J.J. Linderman,《受体:结合模型, 传输与信号》, Oxford U.Pres 对于1>>P:c2)=nSPt 或dm2=smPt 穿行距离~时间2 (扩散运动) 类似于原子和分子的扩散系数(D),对于细胞,我们可以定义运动系数μ: =SPh→())=n或=√4ut(两天) 代表型值范围 09-10-8cm2/sec
9 3.051/BE.340 对于 t >>P：〈d(t)2 〉 = nS2 Pt 或 〈d(t)2 〉 1/2 = S nPt 类似于原子和分子的扩散系数（D），对于细胞，我们可以定义运动系数 µ： µ = S2 P/n ⇒ 〈d(t)2 〉 = n 2 µt 或1/2 = 4µt (两天) 持续时间（P） （min） 比较在同一培养 基上不同类型细 胞迁移的 P 和 S… 速度如何与炎性响 应的发生顺序相 关？ 速度（S）（µm/min） 摘 自 D.A.Lauffenburger 和 J.J.Linderman, 《受体：结合模型， 传输与信号》，Oxford U. Press, 1993 穿行距离~ 时间 1/2 （扩散运动） 代表型值范围： µ~ 10-9-10-8 cm 2 /sec
3.051/BE.340 趋化性 假如趋化性或趋触性(表面绑定信号)介质存在,平均位移非零。 我们可以定量迁移的趋化性的趋化指数,C kd(1)> 1/p L 式中是沿着浓度梯度的平均位移,并且Lpmh是细胞路经长度的总量。 在ⅹ方向上趋化介质的浓度梯度 对于短期(tP):(PC/=2Pkd0 对于长期(D>P:(>P:C=kd (0<C<1)
10 3.051/BE.340 趋化性 假如趋化性或趋触性（表面绑定信号）介质存在，平均位移 非零。 我们可以定量迁移的趋化性的趋化指数，CI： 式中 是沿着浓度梯度的平均位移，并且 Lpath 是细胞路经长度的总量。 在 x 方向上趋化介质的浓度梯度 对于短期（t>P）：