3.051/BE.340 第六讲蛋白质一表面交互作用(续) 朗缪尔模型可以应用于众多可逆吸附过程。 例子 元混合物稀释组分的表面层析 ·=气体的表面物理吸附(压力替代囗) =可逆生物分子作用(例如:受体一配体键合) 对于一般的反应 HR,+mR,←Pr 化学反应的平衡常数是:K 其中a1代表i的活性,对于理想溶液,日是i的摩尔分率。 K’代表反应的标准自由能变化 K (kJ/mol) RTIn K 10 17.1 ForK>1,反应是可行的。 0 意这种自由能的计算只对可逆吸附过程 10 5.7 是有效的。 -17.1
1 3.051/BE.340 第六讲 蛋白质－表面交互作用（续） 朗缪尔模型可以应用于众多可逆吸附过程。 例子： z ＝二元混合物稀释组分的表面层析 z ＝气体的表面物理吸附（压力替代[]） z ＝可逆生物分子作用（例如：受体－配体键合） 对于一般的反应: 化学反应的平衡常数是： 其中 代表 的活性，对于理想溶液，代 是 的摩尔分率。 代表反应的标准自由能变化： 注意这种自由能的计算只对可逆吸附过程 是有效的
3.051/BE.340 朗缪尔模型在很多方面不能应用于蛋白吸附。 1.竞争吸所 体内许多不同种类的球蛋白 表面分布取决于[Pi]’s和时间 oman效应:最初吸附的蛋白逐渐被第二种蛋白取代 Tfng/cm 血浆中FGN,FN,VN 吸附在聚醚聚氨酯上 FGN 200 TEN (摘自 D.J. Fabrizius-Homan 120=和 S.L. Cooper,们生物材料科学 时间(min) 3,1991:27-47) 蛋白质 血浆浓度(mg/m1) 人血清白蛋白 68,500 免疫球蛋白 145,000(IgG) 纤维蛋白原 3.0 00 血清纤维结合蛋白 240,000 体外连接蛋白 0.2 60,000
2 3.051/BE.340 朗缪尔模型在很多方面不能应用于蛋白吸附。 1.竞争吸附 ¾ 体内许多不同种类的球蛋白 ¾ 表面分布取决于[Pi]’s 和时间 Vroman 效应：最初吸附的蛋白逐渐被第二种蛋白取代。 蛋白质 血浆浓度（mg/ml） MW(D) 人血清白蛋白 42 68,500 免疫球蛋白 28 145,000(IgG) 纤维蛋白原 3.0 340,000 血清纤维结合蛋白 0.3 240,000 体外连接蛋白 0.2 60,000 血浆中 FGN，FN，VN 吸附在聚醚聚氨酯上 时间（min） （摘自 D.J.Fabrizius-Homan 和 S.L.Cooper,《生物材料科学》 3，1991：27-47）
3.051/BE.340 假说 Att~0:恒定[Pi]’s→高浓度的蛋白质优先吸附 Att>0:近表面的吸附蛋白的损耗一快速扩散交换 Att>>0:高亲和力蛋白的逐级交换 2.不可逆吸附 ≯体内或体外:蛋白通常长时间暴露在蛋白溶液中并不解吸 >复杂的竞争吸附 吸附了FGN后,表面暴露在血浆 剩余FGN的 百分含量 PDMS Glass (摘自 S.M. Slack和 TA. Corbett,《胶体和界面学》 60 FGN吸附的时间(min) 133,1989:148)
3 3.051/BE.340 假说： At t～0：恒定[Pi]’s⇒ 高浓度的蛋白质优先吸附 At t> 0：近表面的吸附蛋白的损耗－快速扩散交换 At t>>0：高亲和力蛋白的逐级交换 2．不可逆吸附 ¾ 体内或体外：蛋白通常长时间暴露在蛋白溶液中并不解吸 ¾ 复杂的竞争吸附 吸附了 FGN 后，表面暴露在血浆 中 剩余 FGN 的 百分含量 FGN 吸附的时间（min） （摘自 S.M.Slack 和 T.A.Horbett, ，《胶体和界面学》 133，1989：148）
3.051/BE.340 生理学含义: a)疏水表面导致更多的变性 b)变性的蛋白最终会被解吸(被取代)→非溶液固有的行为 此模型可以解释1&2: S.M. Slack和T.A. Corbett,《胶体和界面学》133,1989P.148 I. Lundstroem和H. Elting,们胶体和界面学》136,1990P.68 C.F.Lu,A. Nadarajah和K.K. Chittur,《胶体和界面学》168,1994P.152 3.重建 达到单层饱和的蛋白分子层能够在表面重组(例如:结晶),产生阶梯等温线
4 3.051/BE.340 生理学含义： a) 疏水表面导致更多的变性 b) 变性的蛋白最终会被解吸（被取代）⇒ 非溶液固有的行为 此模型可以解释 1 & 2: S.M.Slack 和 T.A.Horbett, 《胶体和界面学》133，1989 P.148 I.Lundstroem 和 H.Eleing，《胶体和界面学》136，1990P.68 C.F.Lu,A.Nadarajah 和 K.K.Chittur, 《胶体和界面学》168,1994P.152 3.重建 ¾ 达到单层饱和的蛋白分子层能够在表面重组（例如：结晶），产生阶梯等温线 时间 Γ=
3.051/BE.340 4.多层的形成 蛋白能吸附顶部的蛋白单分子层或亚分子层,得到复杂的吸附模型 time P
5 3.051/BE.340 4.多层的形成 ¾ 蛋白能吸附顶部的蛋白单分子层或亚分子层，得到复杂的吸附模型
3.051/BE.340 吸附蛋白的测量 1.吸附蛋白的量化技术 a)标记方法:量化标记蛋白,使用已知的标准尺度 i)放射性同位素标记 采用放射性同位素与特殊的氨基酸残体 例如,采用11;1I:2P CH CH2>OH 把带放射性的蛋白加入到未标记的蛋白中的比例 (较小比例的放射性蛋白加入到未标记蛋白中) y代表测量和标准cpm/pg 优点:高信噪比→可测量微含量(ng) 缺点:Y发射具危险性、存在废物处理、需要蛋白分离 1荧光标记 标记物的可见光激发的荧光测量
6 3.051/BE.340 吸附蛋白的测量 1.吸附蛋白的量化技术 a) 标记方法：量化标记蛋白，使用已知的标准尺度 i) 放射性同位素标记 ¾ 采用放射性同位素与特殊的氨基酸残体 例如，采用 125I；131I；32P ¾ 把带放射性的蛋白加入到未标记的蛋白中的比例 （较小比例的放射性蛋白加入到未标记蛋白中） ¾ γ代表测量和标准 cpm/μg 优点：高信噪比 ⇒ 可测量微含量（ng） 缺点：γ发射具危险性、存在废物处理、需要蛋白分离 ii)荧光标记 ¾ 标记物的可见光激发的荧光测量
3.051/BE.340 例如,荧光素异硫氰酸盐(FITC) 共价结合于胺 优点:化学稳定 缺点:标记会影响到吸附,需要蛋白分离、信号弱 ii1)染色 分子标签吸附到蛋白上 例如,有机染料;抗体(例如,FITC标记) 优点:化学稳定,无蛋白隔离/修饰 缺点:染料无特异性吸附(强干扰) b)其他定量方法 i)表面HPLC(w/Uv检测) )XPS信号强度,例如,N(相对调节) ii)椭圆光度法一吸收层厚度(干)
7 3.051/BE.340 例如，荧光素异硫氰酸盐(FITC) 共价结合于胺 优点：化学稳定 缺点：标记会影响到吸附，需要蛋白分离、信号弱 iii)染色 ¾ 分子标签吸附到蛋白上 例如，有机染料；抗体（例如，FITC 标记） 优点：化学稳定，无蛋白隔离/修饰 缺点：染料无特异性吸附（强干扰） b）其他定量方法 i）表面 HPLC（w/UV 检测） ii）XPS 信号强度，例如，N1s（相对调节） iii）椭圆光度法－吸收层厚度（干）
3.051/BE.340 2.研究吸收动力学的技术 a)原位椭圆光度法 验模型:从固体/液体表面或检测到的单色光的、椭圆型的偏振光 He-Ne激光 光电探测器 可旋转偏光器 l/4波长平板 可现状分析器 样品 吸收的蛋白质层改变了相或反射光的振幅一对于平行或垂直的偏振光有所不同 反射系数 E i E and 's E 振幅比率 相差 tan P= 椭圆光度角ψ和Δ能被转换为吸收层厚度(d)和折射系数(nr假设3层模型和 或菲涅耳光学 n
8 3.051/BE.340 2．研究吸收动力学的技术 a）原位椭圆光度法 ¾ 实验模型：从固体/液体表面或检测到的单色光的、椭圆型的偏振光 ¾ 吸收的蛋白质层改变了相或反射光的振幅－对于平行或垂直的偏振光有所不同 反射系数： 振幅比率： 相差： ¾ 椭圆光度角 ψ 和 ∆ 能被转换为吸收层厚度（df）和折射系数（n f）假设 3 层模型和 或菲涅耳光学 He-Ne 激光 可旋转偏光器 1/4 波长平板 样品 可现状分析器 光电探测器
3.051/BE.340 吸收量 r=ur dn/dc 蛋白质溶液 量对蛋白 优点:无蛋白分离;快速;简单;原位;灵敏 缺点:需要建立一个量化模型,需要光学平坦或反射底层;不能区分不同的蛋白质 参考文献: nga LundstroⅢ,B. Liedburg,《生物材料》19,1998:407-422 2.H.G. Tompkins,《椭圆偏光显微镜的使用指导》, Academic press: San Diego,1993
9 3.051/BE.340 ¾ 吸收量： 优点：无蛋白分离；快速；简单；原位；灵敏 缺点：需要建立一个量化模型，需要光学平坦或反射底层；不能区分不同的蛋白质 参考文献： 1. P.Tengvall, I.Lundstrom, B.Liedburg, 《生物材料》19，1998：407-422 2. H.G.Tompkins,《椭圆偏光显微镜的使用指导》，Academic Press:San Diego,1993
3.051/BE.340 b)表面细胞质基因共振 实验模型:偏振光反射到带有沉积金属胶片的玻璃和液体流动池之间的界面上 液体 K Au或Ag胶片 玻璃 K 偏振光+K2 2D检测器 理论基 穿过高n介质(玻璃)的光将反射回低n(空气/水)的物质界面 =完全内部的反射 ritical critical SIn、/ ●≡表面细胞质基因组一电荷密度波(自由振荡电子)沿着金属和绝缘体的表面传播 (蛋白溶液) =偶联短波到金属胶片上细胞质基因组,当出现6=6p(6cmca)
10 3.051/BE.340 b）表面细胞质基因共振 ¾ 实验模型：偏振光反射到带有沉积金属胶片的玻璃和液体流动池之间的界面上 ¾ 理论基础： z ＝穿过高 n 介质（玻璃）的光将反射回低 n（空气/水）的物质界面 z ＝完全内部的反射 ＝ z ＝表面细胞质基因组－电荷密度波（自由振荡电子）沿着金属和绝缘体的表面传播 （蛋白溶液） z ＝偶联短波到金属胶片上细胞质基因组，当出现 的情况： 液体 玻璃 Au 或 Ag 胶片 偏振光 2D 检测器